吉林省马弓形虫病分子流行病学调查

赵少伟，王 楠，谢素珠，王 浩，张 爽，张煊承，李 航，贾立军*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133000；2.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林 长春 130000)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生的原虫，可感染人和多种动物，其中猫科动物被认为是该病原体的唯一终末宿主[1]。1908年，弓形虫在突尼斯梳齿鼠体内被首次发现[2]，随后在多个国家的多种动物体内被报道，弓形虫病的流行呈现出世界性分布。HAMADA等[3]调查了伊拉克北部地区弓形虫在绵羊和山羊中的流行情况，其中绵羊感染率为42.10%，山羊阳性率为 36.10%；日本地区野生梅花鹿弓形虫的感染率为47.50%[4]；巴西东北部地区犬的弓形虫血清阳性率为9.54%[5]；葡萄牙的驴弓形虫血清阳性率为5.90%[6]；乌克兰地区马弓形虫感染率约为21.10%[7]；OLSEN等[8]对北欧波罗的海地区多种动物感染弓形虫的情况进行汇总，结果显示家猪的血清阳性率为6%、绵羊23%、牛7%、驼鹿16%，野猪的感染率最高为33%。此外，弓形虫病作为一种食源性的人畜共患病，严重威胁着人类的健康。据调查全球约有1/3的人口感染弓形虫，部分地区的血清阳性率高达80%[9]。本病在不同动物中的发病情况有所差异，病症多呈现呼吸、神经及消化系统症状，可导致母畜流产和死胎。在人类感染中可引起孕妇流产、畸胎和死胎等。通过系统的流行病学调查，及时掌握弓形虫在动物中的流行现状，对该病的有效防控具有重要意义。目前，吉林省马感染弓形虫的流行病学调查数据比较缺乏。本次调查应用PCR对吉林省辽源、白城、吉林、通化4个地区的120份马抗凝血进行检测，以期为弓形虫病的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和样本采集FastPure Blood DNA Isolation Mini Kit为Vazyme产品；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒均为OMEGA产品；Trans 5α感受态细胞、Ex Taq酶、dNTP Mix、pMD18-T载体、DL2000 DNA Marker等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

从吉林省辽源、白城、吉林、通化4个地区规模场和散养户中随机挑选马共120匹。无菌采集抗凝血，分装保存，以备DNA提取。

1.2 引物合成弓形虫B1基因PCR引物参照JONES等[10]方法。引物由上海英潍捷基公司合成(表1)。

1.3 基因组DNA提取及PCR扩增按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取血液样本的基因组DNA，应用弓形虫B1基因引物进行PCR扩增。PCR 反应体系为25 μL：10×Taq Buffer(Mg2+,15 mmol/L) 2.5 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1.5 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.3 μL，ddH2O补足至25 μL。混匀后置PCR仪中扩增，反应条件为：93℃预变性 5 min；93℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后于72℃延伸7 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像仪中拍照观察。

表1 弓形虫B1基因PCR引物

1.4 克隆载体的构建及测序利用OMEGA凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行胶回收，将回收后的目的片段连接pMD18-T载体，体系为：胶回收产物4 μL，SolutionⅠ5 μL，pMD18-T 1 μL。连接产物于Trans 5α感受态中转化。转化产物涂布于AMP抗性平板，37℃恒温培养10～14 h，挑取单个菌落摇菌扩增。使用OMEGA的质粒提取试剂盒提取质粒，质粒鉴定阳性的菌液送上海英潍捷基公司测序。

1.5 统计分析测序结果利用NCBI BLAST在线工具进行比对，采用MegAlign基因同源性分析；并对检测结果进行不同地区、不同饲养模式及不同性别马感染弓形虫情况统计学分析。

2 结果

2.1 弓形虫B1基因PCR检测马血液基因组样本经PCR扩增获得大约193 bp的目的条带，与预期结果相符(图1)。PCR共检测出阳性11份。将扩增得到的目的基因，经转化克隆后全部送公司测序，测序结果经NCBI BLAST同源性比对，11份测序样本均与弓形虫B1基因相符(GenBank 登录号AF179871.1)。

2.2 扩增基因进化分析采用MegAlign对扩增弓形虫B1基因进行同源性分析，构建进化树(图2,3)。本次调查扩增虫株B1-T.gondii-horse与墨西哥羊体内虫株(GenBank:KX270363.1)处于同一分支，同源性为100.0%。与其他参考虫株间的基因同源性为81.4%～100.0%，说明扩增虫株与目前流行虫株具有普遍同源性。

图1 部分马血液样本PCR检测结果 M.DL2000 DNA Marker；1.阳性对照；2,3.检测马血液样本；4.阴性对照

2.3 不同地区马弓形虫感染情况对采自吉林省境内4个不同地区的共120份血液样本进行PCR检测。各地马弓形虫感染情况见表2。经统计分析，除白城和通化地区间差异不显著(P>0.05)外，其他各地区间差异显著(P<0.05)。

2.4 不同养殖模式马弓形虫感染情况利用PCR法对采集的120份马血液进行检测，并分析不同养殖模式对弓形虫感染率的影响。结果显示，规模化养殖和散养条件下均有弓形虫感染(表3)，统计学分析表明，不同养殖模式下马弓形虫感染率差异显著(P<0.05)。

图2 不同虫株间B1基因同源性比对

图3 不同虫株间B1基因序列进化树

表2 不同地区马弓形虫感染情况

表3 不同养殖模式马弓形虫感染情况

2.5 不同性别间弓形虫感染情况对采集的120份马血液进行PCR检测，分析弓形虫病在不同性别的流行情况。结果显示，不同性别马均有弓形虫感染(表4)，但差异不显著(P>0.05)。

表4 不同性别马弓形虫感染情况

3 讨论

弓形虫病是一种人畜共患病，弓形虫可感染多种哺乳动物、鸟类以及人类[11]。猫科动物是弓形虫的终末宿主，卵囊随其排泄物散布于周围环境，其他动物通过饮用被卵囊污染的水源或进食污染的食物等而被感染。人类多因食用感染动物的肉制品、奶制品等而患病[12]。ZHANG等[13]调查了吉林省境内野生水禽的弓形虫感染率，结果显示总体阳性率为7.20%。曹利利等[14]利用LAMP法对吉林省部分地区猪弓形虫的流行情况进行了调查，阳性率为7.80%；赵鹏等[15]对长春地区牛感染弓形虫的情况进行了调查，总体阳性率为6.00%。伍生军等[16]采用ELISA法对延边地区鸡群中的弓形虫进行检测，发现鸡弓形虫阳性率为19.64%。综上所述，弓形虫在吉林省多个地区的多种动物中均有感染，危害着养殖企业的发展及人类健康。

据FAO(世界粮农组织)统计，目前我国马的存栏量位居世界第三[17]。近年来，我国马感染弓形虫的情况时有报道。调查显示，辽宁地区马弓形虫感染率为25.00%[18]，云南马弓形虫血清阳性率为30.50%[19]，青海马弓形虫感染率为5.10%[20]，新疆马弓形虫感染率为7.00%[21]，山东驴弓形虫血清阳性率为16.75%[22]。因此，对马弓形虫病的研究具有重要意义。分子生物学法检测弓形虫比血清学方法具有更高的特异性和灵敏性[23]。此次调查利用PCR 法对采自辽源、白城、吉林、通化4地的120份马血液进行检测，以期了解马弓形虫的流行现状。PCR检测结果显示，120份血液样本检测出阳性11份，总体阳性率为9.17%，比ZHANG等[24]调查的6.48% 和REN等[25]调查的5.15%略高，出现差异的原因可能与样本采集地区和采样时间等因素相关。不同地区间马弓形虫感染率差异显著(P<0.05)，其中辽源地区弓形虫阳性率最高为14.30%，最低为吉林3.30%；马不同性别间弓形虫感染率差异不显著(P>0.05)。不同养殖模式的马弓形虫感染率差异显著(P<0.05)，散养弓形虫阳性率(11.1%)比规模场(3.30%)高，可能与散养条件饲养管理松散，环境内猫的存在等因素有关。与ZHANG等[24]和MENG等[22]调查结果稍有不同，具体原因有待于进一步研究。

本次调查丰富了马感染弓形虫的流行病学数据，证实吉林省马弓形虫感染的普遍存在，为兽医部门实施有效防控提供科学依据。此外，养殖企业要加强饲养管理，提高环境卫生，忌喂食污染饲料，尤其严格控制厂区内猫等动物的活动，对弓形虫防控具有重要意义。