6-DMAP 诱导黄河口近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)三倍体的研究*

李海昆 刘 洋 李春华 王永旺 于瑞海

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室 青岛 266003)

自1981 年首次报道用细胞松弛素B(CB)成功诱导美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的三倍体以来， 牡蛎的多倍体育种就成为了牡蛎育种的重要研究方向(Stanleyet al， 1981)。三倍体牡蛎育性差， 在繁殖季节不会因繁殖活动导致软体部消瘦， 因而可以全年保持较好的品质(Allenet al， 1986a； Nell， 2002)； 三倍体牡蛎在最适的生存条件下要比二倍体牡蛎生长快， 且在繁殖季节死亡率低(Piferreret al， 2009； Dégremontet al， 2012； Peacheyet al， 2016)； 此外， 三倍体的不育性还可避免基因污染， 具有一定的生态优势(Piferreret al， 2009； Peacheyet al， 2016)。这些有益的生态价值和经济价值， 使三倍体牡蛎深受国内外养殖者的欢迎， 其养殖产量在世界牡蛎养殖产量的占比不断提高(Peacheyet al， 2016)。目前获得三倍体牡蛎的方法有两种， 一种是通过物理方法(Allenet al， 1986b)或者化学方法(Downinget al， 1987； Gérardet al， 1999)诱导获得， 另一种是用四倍体和二倍体杂交获得100%的全三倍体(Guoet al， 1994， 1996)。获得全三倍体牡蛎的关键是四倍体的获得， 而四倍体诱导离不开三倍体牡蛎(Guoet al， 1994)， 因此三倍体牡蛎的高效诱导是牡蛎多倍体育种的前提。目前， 国内学者已经利用不同方法对我国常见的几种巨牡蛎属牡蛎开展了三倍体的研究， 包括长牡蛎(C. gigas)(于瑞海等， 2000； 王康， 2014)、近江牡蛎(王康， 2014)、香港牡蛎(C. hongkongensis)(秦艳平等， 2017)、熊本牡蛎(C. sikamea)(武祥伟等， 2019)。

近江牡蛎主要分布于太平洋西海岸的河口区， 由于其具有生长快、抗病性强的特点， 曾被美国考虑作为一个新的养殖对象引进(Calvoet al， 2001； Yoonet al， 2008)。近江牡蛎在我国的南北方均有分布， 是我国自然分布的几种比较重要的巨牡蛎属牡蛎之一(张跃环等， 2014)。目前国内关于近江牡蛎的育种研究主要集中于杂交育种上， 关于近江牡蛎的多倍体育种的研究较少。

三倍体近江牡蛎具有生长快、存活率高、抗病性强的特点(Calvoet al， 2001)， 开展近江牡蛎的三倍体的诱导研究对开展近江牡蛎的三倍体育种， 进一步提高我国养殖牡蛎的质量具有重要意义。早在2008年， 杨春玲等(2008)就已经进行了6-DMAP 诱导近江牡蛎三倍体的研究， 但是当时的“近江牡蛎(C. rivularis)”还没有与香港牡蛎完全区分开， 实验中所用的近江牡蛎可能混有香港牡蛎(Lamet al， 2003； Wanget al， 2004； 王海艳等， 2007)， 且研究评估6-DMAP 诱导效果的指标单一， 研究内容不够完善。本实验中， 近江牡蛎取自东营市黄河三角洲地区河口区域， 具有个体较大、壳厚重的特点(Xiaoet al， 2010)， 为真正意义上的北方近江牡蛎； 使用的诱导药物为 Desrosiers 等(1993)提出的毒害作用较小的6-DMAP。本次研究从诱导浓度、起始诱导时间、诱导持续时间三个水平探究6-DMAP 对近江牡蛎的诱导效果， 并结合卵裂率、孵化率、三倍体率和诱导后诱导组幼虫的生长率、存活率、三倍体率变化情况6 个评估指标， 建立了6-DMAP 诱导近江牡蛎三倍体的方法， 为黄河口近江牡蛎的多倍体育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 亲贝暂养

近江牡蛎亲贝采自东营市黄河三角洲， 4—5 龄， 挑选无损伤、左壳凹凸明显的个体作为实验亲贝。2019 年5 月1 日运至莱州市长渔水产有限公司育苗车间进行暂养， 暂养期间投喂新月菱形藻(Nitzschia closterium)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)， 每天移池换水一次。5 月底性腺同步成熟进行实验。

1.2 解剖获取精卵、受精

解剖亲贝后， 用牙签挑破性腺， 蘸取性腺滴于载玻片的水滴上， 若呈烟雾状为雄性个体， 若呈颗粒状则为雌性个体。在显微镜下观察每个个体的卵子质量以及精子活力。选择卵子梨形或卵圆形、卵颜色较深的个体作为母本， 卵液先用200 目的筛绢过滤较大的杂质， 然后用500 目的筛绢洗卵3 次， 最后将洗好的卵置于过滤海水(温度25°C， 盐度29)中促熟30min； 选择精子活力较强的个体作为父本， 精液用200 目的筛绢过滤。受精前检查卵子是否污染， 受精时保证每个卵子周围6—10 个精子。

1.3 6-DMAP 的诱导处理

所有的诱导实验均在3L 的塑料桶中进行， 诱导密 度 为 3.0×107个/mL， 温 度 均 为 25°C； 参 考Desrosiers 等(1993)、Gèrard 等(1999)、秦艳平等(2017)对6-DMAP 的使用， 设计诱导浓度、诱导时机、诱导持续时间3 个因素， 每个因素设计4 个水平， 每组实验均重复3 次。

1.3.1 诱导浓度实验 受精后将受精卵平均分成4 份， 受精后18min 将四份受精卵分别在150、300、450 和600μmol/L 的6-DMAP 中诱导处理15min。

1.3.2 诱导时机实验 受精后将受精卵平均分成4 份， 分别在受精后10、14、18 和22min 用浓度实验中获得最佳诱导浓度进行诱导， 诱导持续15min。

1.3.3 诱导持续时间实验 受精后将受精卵平均分成4 份， 采用诱导浓度实验、诱导时机实验中获得最佳诱导条件进行诱导， 分别持续诱导10、15、20 和25min。

诱导结束后用500 目筛绢洗受精卵3 次， 之后将受精卵转移至60L 的塑料桶中进行孵化， 孵化过程中连续充气， 并每间隔2h 搅动一次小桶， 避免受精卵下沉。受精2h 后取样测量各组的卵裂率。24h 后测量各组的孵化率， 并将孵化获得的一部分D 形幼虫制成细胞悬液固定于75%的酒精中， 用流式细胞仪(Beckman CoulterCytoFLEX， 美国)检测倍率。

1.4 幼虫培育

将不同诱导浓度、不同起始诱导时间、不同诱导持续时间获得的D 形幼虫继续培养。幼虫培育期间， 投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)， 每天投喂6 次， 日投饵量6000—8000cells/mL； 水温25—27°C， 每天换水两次， 每次换水50%。每隔4 天随机取30个幼虫测量壳高， 同时测每组的存活率， 连续观察至第25 天； 在50%壳顶期幼虫和50%眼点幼虫两个时期， 收集幼虫制成细胞悬液固定于 75%酒精中， 用于倍率检测。

1.5 数据处理

用SPSS18.0 进行数据处理， 进行单因素方差分析比较不同处理的诱导效果， 并进行Duncan 多重比较分析不同处理下卵裂率、孵化率、三倍体率、幼虫的壳高和存活率指标的差异， 显著水平设为0.05。

2 结果

2.1 6-DMAP 对近江牡蛎三倍体的诱导效果

2.1.1 诱导浓度 随诱导浓度的增加受精卵的卵裂率逐渐降低； 诱导浓度150、300 和450μmol/L 组的孵化率无显著性差异(P＞0.05)， 诱导浓度为600μmol/L 时的孵化率显著小于诱导浓度为150μmol/L和300μmol/L 时的孵化率(P＜0.05)； 诱导浓度为300、450 和 600μmol/L 时的三倍体率无显著性差异(P＞0.05)， 但均显著高于诱导浓度为150μmol/L 时的三倍体率(P＜0.05)； 诱导浓度为450μmol/L 时诱导获得三倍体率最高达60.67%±5.63%(图1)。

图1 不同的诱导浓度下卵裂率、孵化率和三倍体率 Fig.2 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different induction concentrations

2.1.2 起始诱导时间 起始诱导时间对卵裂率影响较小， 起始诱导时间14、18 和22min 时的卵裂率无显著性差异(P＞0.05)， 但均显著低于起始诱导时间10min 时的卵裂率； 不同的起始诱导时间下的三倍体率差异较大， 起始诱导时间为受精后14min 时， 诱导获得的三倍体率最高为69.34%±2.11%(图2)。

2.1.3 诱导持续时间 随诱导持续时间的增加， 卵裂率和孵化率均降低； 诱导持续时间25min 时， 卵裂率和孵化率均不到60%。持续诱导时间15min 和20min 两组的三倍体率显著高于另外两组的三倍体率(P＜0.05)， 但两组内的三倍体率无显著性差异(P＞0.05)， 持续诱导时间为20min 时， 诱导获得三倍体率最高为60.32%±2.01%(图3)。

2.2 不同的6-DMAP 诱导条件下诱导组幼虫的生长情况

幼虫培育的前5 天， 不同诱导浓度下的诱导组幼虫壳高均无显著性差异(P＞0.05)； 培育的第10—20 天， 诱导浓度为600μmol/L 时的诱导组幼虫壳高最小， 显著小于诱导浓度为300μmol/L 时幼虫的壳高(P＜0.05)， 诱导浓度为150、300 和450μmol/L 时的诱导组幼虫的壳高无显著性差异(P＞0.05)； 培育的第20—25 天， 诱导浓度150、300 和450μmol/L 时诱导组幼虫的壳高无显著性差异(P＞0.05)， 但均高于浓度为600μmol/L时幼虫的壳高(图4)。

图2 不同的起始诱导时间下卵裂率、孵化率和三倍体率 Fig.2 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different initial induction times

图3 不同的诱导持续时间下卵裂率、孵化率和三倍体率 Fig.3 Cleavage rate， hatching rate， and triploid rate in different induction durations

在培育的25 天内， 起始诱导时间为受精后14、18 和22min 时诱导组幼虫的壳高始终无显著性差异(P＞0.05)； 幼虫培育的前10 天， 不同的诱导起始时间下诱导组幼虫的壳高均无显著性的差异(P＞0.05)； 培 育的第15—20 天， 起始诱导时间10min 时诱导组幼虫的壳高均显著高于起始诱导时间18min 时诱导组幼虫的壳高(P＜0.05)(图5)。

图4 不同的诱导浓度下三倍体诱导组幼虫的生长情况 Fig.4 The growth of triploid induced larvae under different induction concentrations

图5 不同的起始诱导时间下三倍体诱导组幼虫的生长情况 Fig.5 The growth of triploid induced larvae under different initial induction times

在培育的25 天内， 诱导持续时间为10、15 和20min 时诱导组幼虫的壳高无显著性差异(P＞0.05)； 在培育的前10 天， 不同的诱导持续时间下的诱导组幼虫的壳高无显著性差异(P＞0.05)； 在培育的第15—20 天， 诱导持续时间为10、15 和20min 的诱导组幼虫壳高均显著高于持续诱导时间为25min 时幼虫的壳高(P＜0.05)； 培育的25 天内， 持续诱导时间为25min 时的诱导组幼虫壳高均最小(图6)。

2.3 不同的诱导条件下幼虫的存活情况

在培育的 25 天内， 诱导浓度 150、300 和450μmol/L 时的诱导组幼虫存活率均无显著性差异(P＞0.05)； 在培育的15—25 天， 诱导浓度150、300和450μmol/L 时的诱导组幼虫的存活率均显著高于诱导浓度 600μmol/L 时的诱导组幼虫存活率(P＜0.05)。起始诱导时间对幼虫存活影响较小， 在培育第15 天之后各起始诱导时间之间的诱导组幼虫的存活率均无显著性差异(P＞0.05)； 在培育的第10 天， 起始诱导时间10min 时的诱导组幼虫的存活率显著低于其他各诱导组幼虫存活率(P＜0.05)。在培育的前20 天内， 持续诱导时间10、15 和20min 时的诱导组幼虫的存活率无显著性差异(P＞0.05)， 但均显著高于持续诱导时间 25min 时诱导组幼虫的存活率(P＜0.05)(表1)。

不同的6-DMAP 诱导组合下的三倍体诱导组幼虫的日平均生长率无显著性差异(P＞0.05)。培育25天内， 诱导浓度为150、300 和450μmol/L 的三倍体诱导组幼虫平均存活率无显著性差异(P＞0.05)， 但均显著高于诱导浓度为600μmol/L 时的三倍体诱导组幼虫的平均存活率(P＜0.05)。起始诱导时间为10min时的三倍体诱导组幼虫的平均存活率显著小于起始诱导时间为14min 时的三倍体诱导组幼虫的平均存活率(P＜0.05)。不同的持续诱导时间下， 三倍体诱导组幼虫的平均存活率差异较小， 诱导持续10、15 和20min 时的三倍体诱导组幼虫的平均存活率无显著性差异 (P＞0.05)， 但均显著高于诱导持续时间为25min 时的三倍体诱导组幼虫的平均存活率(P＜0.05)(表2)。

图6 不同的持续诱导时间下三倍体诱导组幼虫的生长情况 Fig.6 The growth of triploid induced larvae under different induction durations

表1 不同的6-DMAP 诱导条件下三倍体诱导组幼虫的存活率 Tab.1 Survival rate of triploid induced larvae under different 6-DMAP induction conditions

2.4 不同的诱导条件对三倍体近江牡蛎诱导的影响程度比较

不同的诱导持续时间对卵裂率产生极显著差异影响(P＜0.01)， 且对应的极差最大， 因此诱导持续时间对卵裂率的影响程度最大， 三个诱导条件对卵裂率的影响程度为诱导持续时间＞诱导浓度＞起始诱导时间； 三个诱导条件对孵化率的影响程度为起始诱导时间＞诱导浓度＞诱导持续时间； 三个诱导条件对三倍体率的影响程度为起始诱导时间＞诱导浓度＞诱导持续时间。诱导浓度和诱导持续时间是影响幼虫平均存活率的主要因素(表3)。

2.5 不同幼虫期各三倍体诱导组幼虫三倍体率变化情况

幼虫培育期间， 各三倍体诱导组幼虫的三倍体率均有所下降， 诱导浓度600μmol/L 和诱导持续时间25min 两组的三倍体率下降超过10%， 其他各组三倍体率下降均为超过10%， 变化不显著(P＞0.05)。多数情况下， 三倍体率的下降主要集中于壳顶期幼虫之前， 壳顶期幼虫之后三倍体率变化较小(图7)。

3 讨论

3.1 6-DMAP 诱导黄河口近江牡蛎三倍体方法的探讨

从三倍体诱导原理上看， 起始诱导时间的控制是把握极体排放时机的关键， 诱导浓度是作用强度

的体现， 这两个因素是决定三倍体率的主要因素， 本次实验的结果也证明了这一点。杨春玲等(2008)诱导“近江牡蛎(C. rivularis)”三倍体时， 也认为起始诱导时间和诱导浓度是决定诱导三倍体率的主要因素。田传远等(1999)认为诱导持续时间对长牡蛎三倍体诱导率无显著性影响， 而本实验中诱导持续时间是三因素中对三倍体率影响最小的因素， 这说明诱导持续时间是三个因素中对诱导三倍体率影响最小的一个因素。持续诱导时间和诱导浓度是影响卵裂率的主要因素， 推测原因是较高的诱导浓度和较长的诱导时间使受精卵受到一定的毒害作用， 受精卵不能正常分裂(田传远等， 1998)。持续诱导时间对胚胎的孵化率没有显著性的影响， 这与CB 诱导熊本牡蛎的结论相反， 推测原因是6-DMAP 毒性比CB 的毒性小， 其毒害作用是瞬间的， 因此其毒害作用主要集中于受精卵时期， 而对胚胎的影响较小， 因此卵裂率受该因素的影响较大， 而孵化率几乎不受该因素的影响(田传远等， 1998； 武祥伟等， 2019)。综合来看， 三个诱导条件对三倍体诱导效果的影响程度为起始诱导时间＞诱导持续时间＞诱导浓度。

表2 培育25 天内不同的6-DMAP 诱导条件下三倍体诱导组幼虫的生长存活比较 Tab.2 Comparison on growth and survival of triploid induced larvae under different 6-DMAP induction conditions on the 25th day

表3 不同的诱导条件对三倍体近江牡蛎诱导的影响程度比较 Tab.3 Comparison on effects of different induction conditions on triploid C. ariakensis induction

图7 不同的诱导条件下三倍体诱导组幼虫的三倍体率的变化 Fig.7 Variation of triploid rate of triploid induced larvae in different induced conditions

较高的诱导浓度(600μmol/L)和较长的持续诱导时间(25min)下三倍体诱导组幼虫生长慢且存活率显著低， 若以三倍体诱导组幼虫的生长、存活和三倍体率变化作为考量诱导效果的指标， 只能说明诱导浓度600μmol/L、诱导持续时间25min 两个条件下诱导效果较差， 而其他的条件下均无显著性差异。综合三倍体 D 形幼虫的产量和诱导组幼虫的情况来看， 6-DMAP 诱导黄河口近江牡蛎三倍体的最佳组合是： 诱导浓度为300—450μmol/L， 起始诱导时间为受精后14min， 持续诱导时间为15min。

3.2 三倍体诱导组幼虫的生长存活探讨

从幼虫壳高变化看， 诱导浓度600μmol/L 和持续诱导时间25min 时的幼虫在培育的第5—15 天内， 生长速度明显减慢， 幼虫壳高显著小于组内其他条件下幼虫的壳高。武祥伟等(2019)用CB 诱导获得的熊本牡蛎三倍体群幼虫在培育前期出现大量死亡现象， 作者认为死亡率高的原因之一是CB 的毒性大， 对胚胎产生了毒害作用。虽然本实验中用到的6-DMAP的毒性小， 但当诱导浓度过大和诱导时间过长时， 胚胎处于极度不适应的环境中， 会受到潜在的伤害， 而这种潜在的伤害会在D 形幼虫初期表现出来—生长迟滞和高死亡率(田传远等， 2000)。在培育的前期， 幼虫的死亡率急剧下降， 尤其是诱导强度较强时(高诱导浓度和长的诱导持续时间)， 这种现象尤为明显。由于极体排放不同步， 高强度的诱导使得第一极体被抑制的几率大大增加， 导致染色体多级分离产生非整倍体(Guoet al， 1992； 田传远等， 1999)， 这些非整倍体幼虫虽然不存在生长迟滞现象(Guoet al， 1996； Wanget al， 1999)， 但 是 其 存 活 能 力 低(武 祥 伟 等， 2019)， 造成整组在培育初期存活率急剧下降。

3.3 三倍体诱导组幼虫的三倍体率变化情况分析

培育至眼点幼虫时期， 多数情况下幼虫三倍体率下降幅度较小， 均未超过10%， 只有诱导强度过大时三倍体率下降显著。诱导浓度600μmol/L 和持续诱导时间25min 两组幼虫时幼虫死亡率均较高， 同时三倍体率急剧下降， 较高的诱导强度获得了较多的非整倍体， 非整倍体存在会降低三倍体率(Heet al， 2000)。因此在用6-DMAP 诱导近江牡蛎三倍体时， 诱导浓度不能太大且诱导持续时间不能太长， 否则三倍体产量会大大下降。此外， 三倍体染色体的丢失也是造成三倍体率下降的重要原因， 多倍体牡蛎由于体内多了一套染色体而具备了许多二倍体牡蛎不具有的特点， 但其额外的染色体组使其细胞分裂紊乱的几率增加， 容易产生非整倍体嵌合体， 甚至逆转回二倍体(de Sousaet al， 2016)。

4 结论

本研究认为， 温度25°C， 盐度29 的条件下， 诱导浓度为300—450μmol/L， 起始诱导时间为受精后14min， 诱导持续时间为15min 时， 6-DMAP 诱导黄河口近江牡蛎三倍体的效果较好。