右美托咪定对老年患者单肺通气相关肺损伤时NLRP3/Caspase-1通路的影响

王 磊，白艳辉，丁彦玲，冯 伟，王 兰，高 璐

(1.保定市第一中心医院 麻醉科,河北 保定 071000；2.保定市第一中心医院 药剂科,河北 保定 071000；3.保定市第一中心医院 胸外科,河北 保定 071000)

随着老龄化程度的不断加重，行胸科手术治疗的老年患者人数亦随之增加，胸科手术往往需要单肺通气，但此操作会造成肺内分流、通气/血流比例失调以及肺复张后因氧化应激及炎性反应还会造成肺损伤[1-3]。而老年患者随年龄增长，自身各系统、器官功能均已发生退行性改变[4]，这些因素给围术期管理更是带来极大挑战。NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体由NLRP3、接头蛋白ASC和胱冬肽酶-1(Caspase-1)构成，在机体免疫反应和疾病发生过程中发挥了关键作用[5-6]。NLRP3/Caspase-1信号通路的激活可参与机体多种生理病理过程，但过度激活则会导致嗜中性粒细胞的大量聚集，造成炎症相关的组织损伤[7]。右美托咪定作为α2受体激动剂，可减轻炎症反应，保护组织器官功能[8-10]。故本研究以NLRP3/Caspase-1信号通路为切入点，以行单肺通气老年患者为观察对象，拟探讨NLRP3/Caspase-1信号通路在右美托咪定减轻单肺通气所致肺损伤的影响，为老年患者行胸科手术提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经本院伦理委员会批准(批号：2019-011)，并与患者或其家属签署知情同意书。选择拟行择期胸科手术患者64例，性别不限，年龄65～80岁，体重指数<30 kg/m2，ASA分级Ⅱ级或Ⅲ级，所有患者均无严重心脑血管疾病，无慢性阻塞性或限制性肺病，用力肺活量>80%预计值，第一秒呼气率>70%预计值，预计手术时间≤4 h。采用随机数字表法分为对照组(C组)和右美托咪定组(D组)，各32例。

1.2 麻醉方法 患者均无术前麻醉用药，入室后常规面罩吸纯氧2 L/min，监测MAP、HR、ECG、SpO2和脑电双频指数(BIS)，建立外周静脉通路，输注复方氯化钠注射液8 mL/(kg·h)。对侧肘静脉留置静脉套管备静脉采样，局麻下桡动脉穿刺行持续有创动脉血压监测。参照文献并结合临床经验[11]，D组于麻醉诱导前15min，静脉持续泵入右美托咪定(批号：H20183219，扬子江药业集团有限公司)负荷量0.5μg/kg，继以0.3 mL/(kg·h)的速率持续泵入至术毕前30 min，C组给与等容量的生理盐水。两组麻醉诱导均采用静脉注射咪达唑仑0.04 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg、异丙酚2.0 mg/kg、顺阿曲库铵0.15 mg/kg，诱导平稳后经口顺利插入双腔支气管导管(根据年龄、身高预测双腔管大小，气管内径值=0.032×年龄(岁)+0.072×身高(cm)-2.043。根据性别、身高预测置管深度，男性置管深度(cm)=0.11×身高(cm)+10.53；女性置管深度(cm)=0.11×身高(cm)+10.94)，纤维支气管镜辅助确定气管导管位置良好后，接麻醉机行机械通气，设置潮气量为8 mL/kg，通气频率12次/min，吸呼比1∶2，PEEP为0 cm H2O，吸入氧浓度50%，氧流量1.0 L/min，维持PETCO2分压35～45 mmHg。麻醉维持以吸入1.5%～2.0%七氟醚(麻醉深度在1.0 MAC)为主，间断静脉注射顺阿曲库铵5 mg维持肌松，舒芬太尼5～10 μg，维持BIS值45～60，MAP、HR波动幅度不超过基础值的20%。OLV时潮气量为6 mL/kg，通气频率调整为12～15次/min，吸入氧浓度100%，PEEP为3cmH2O，其它通气参数维持不变。若术中发生低氧血症(SpO2<90%时间长于3 min)时，经纤维支气管镜再次确认双腔气管导管位置及吸痰、实施正压通气等措施仍无效者，退出本研究并改为其它方法改善患者氧合状态。

1.3 观察指标

1.3.1 记录患者年龄、性别、体重指数、ASA分级等一般情况，记录手术时间、OLV时间等术中情况。

1.3.2 于麻醉诱导前15 min(T0)、OLV 30 min(T1)、OLV 90 min(T2)、恢复双肺通气即刻(T3)分别采集桡动脉血2mL，利用血气分析仪(型号为ABL80，丹麦)计算OI=PaO2/FiO2，于T1-3计算Cdyn=VT/(Pmax-PEEP)。

1.3.3 ELISA检测 于T0-3时抽取外周静脉血，参照试剂说明，以1 000×g离心1 5min分离血清置于-80 ℃冰箱保存待测，采用ELISA检测IL-1β、IL-18和SP-A浓度(试剂盒由Becton Dickinson公司提供)。操作过程严格按照试剂说明书进行。

1.3.4 qRT-PCR检测 于T0-3采集标本后用Ficoll分层液法分离外周血单个核细胞，加入Trizol试剂(购自Invitrogen公司)裂解细胞充分振荡裂解后提取总RNA，选择OD260/280值在1.6～2.0之间的总RNA标本，加RNasin后置于-80℃冰箱保存备用。取1μg RNA作为模板用于cDNA的合成，反应体系20μL，反应条件37℃ 60min，95℃ 5min，所得cDNA于-20℃保存。具体流程按照逆转录试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明书进行。引物的设计合成(由上海生工生物工程有限公司完成)见表1。采用PCR试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行real-time PCR，反应体系为20μL，包括2 × real time PCR缓冲液10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水补足致20μL。反应条件：95℃预变性5min，93℃变性20s，56℃退火20s，75℃延伸30s，进行40个循环。每个样本做2个复孔，以GAPDH为内参照基因，采用Image-pro plus 6.0软件(Media Cybernetics)进行分析，以积分光密度值反映目的基因表达，用2-△△Ct(△△Ct=D组平均△Ct-C组平均△Ct)计算表达差异的倍数。用2-△△Ct表示目的基因相对表达量。

表1 基因扩增引物序列

2 结果

2.1 两组老年患者一般情况及术中各项指标比较 两组老年患者的性别构成、年龄、BMI、ASA分级、手术时间和OLV时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组老年患者一般情况和术中各项指标比较(n=32)

2.2 两组老年患者不同时间点OI和Cdyn的比较 与同组T0比较，老年患者在T1-3时OI降低(P<0.05)；与C组比较，D组老年患者在T1-3时OI、Cdyn升高(P<0.05，见表3)。

表3 两组老年患者不同时间点OI和Cdyn的比较

2.3 两组老年患者不同时间点IL-1β、IL-18、SP-A浓度比较 与同组T0比较，老年患者在T1-3时外周血IL-1β、IL-18、SP-A浓度上升(P<0.05)；与C组比较，D组老年患者在T1-3时外周血IL-1β、IL-18、SP-A浓度下降(P<0.05，见表4)。

表4 两组老年患者不同时间点IL-1β、IL-18、SP-A浓度比较

2.4 两组老年患者不同时间点NLRP3 mRNA 与Caspase-1 mRNA表达比较 与同组T0比较，老年患者在T1-3时NLRP3 mRNA 和Caspase-1 mRNA表达上调(P<0.05)；与C组比较，D组老年患者在T1-3时NLRP3 mRNA 和Caspase-1 mRNA表达下调(P<0.05，见表5)。

表5 两组老年患者不同时间点NLRP3 mRNA 与Caspase-1 mRNA表达比较

3 讨论

NLRP3炎性小体由于能被多种类型的病原体或危险信号所激活，故作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发生过程中发挥了关键作用[5-6]。正常状态下胞内NLRP3的表达量极低，不能用于组装或活化NLRP3炎性小体，只能保持不活跃但有应答的泛素化状态。在一定条件下被激活后，便会诱发下游通路炎性因子(如IL-1β和IL-18)释放来调整机体炎症反应。虽然NLRP3炎性小体的激活有助于宿主抵御入侵的病原微生物及内源性危险信号，但过度激活则会导致嗜中性粒细胞的大量聚集，造成炎症相关的组织损伤。刘振宁等[7]实验发现，百草枯中毒所致急性肺损伤模型中，大鼠肺组织中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著升高，肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-1β和IL-18浓度明显上升，证明激活的NLRP3/Caspase-1信号通路参与其中。本实验根据手术需要在将患者转为单肺通气后，以及手术操作完成后再转为双肺通气后，因通气侧肺机械性损伤、高灌注性损伤及非通气侧肺复张性损伤、缺血再灌注损伤，T1-3时发现外周血IL-1β、IL-18、SP-A浓度升高，单核细胞中的NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表达上调，提示NLRP3/Caspase-1通路参与了单肺通气所致的肺损伤。

右美托咪定作为α2受体激动剂，可减轻炎症反应，减轻单肺通气造成的肺损伤[12-13]。本研究观察两组老年患者在单肺通气时，D组较C组T1-3时氧合指数和肺动态顺应性升高(P<0.05)，SP-A浓度降低(P<0.05)，提示右美托咪定可改善单肺通气期氧合及肺动态顺应性，减轻肺损伤。李灵丰等[14]实验证实右美托咪定通过抑制大鼠NLRP3炎症小体的激活，可降低炎性反应，减轻胸部撞击-失血性休克复苏所致的急性肺损伤。在体外高氧处理的RAW264.7细胞和体内制作高氧血症所致急性肺损伤模型中发现，右美托咪定通过抑制NLRP3炎性小体的激活，可改善高氧血症引起的急性肺损伤[15]。本研究发现D组较C组在T1-3时炎性因子IL-1β、IL-18浓度降低(P<0.05)，T1-3时外周血单核细胞中的NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表达下调(P<0.05)，提示NLRP3/Caspase-1信号通路的下调参与了右美托咪定减轻单肺通气所致的炎性反应。但本研究不足之处：样本量较少且为单中心试验，存在一定的临床局限性，其结果的普遍性还需多中心、大样本的临床试验进一步论证。

综上所述，行胸科手术的老年患者在围术期应用右美托咪定，可改善术中氧合及肺动态顺应性，降低炎性因子，减轻炎症反应，其机制可能与右美托咪定下调NLRP3/Caspase-1信号通路有关。