急性白血病患者流式细胞术外周血细胞检测的临床意义

姚声盛，刘小敏，杨晓婷

深圳市龙华区中心医院检验科，广东深圳 518110

急性白血病（acute leukemia，AL）是临床常见的血液系统恶性肿瘤， 主要病理特点为骨髓中异常原始细胞和幼稚细胞大量增殖，并抑制骨髓的造血功能[1]。 AL 如不能有效治疗，患者的平均生存时间仅为3 个月，严重者甚至在确诊后数日内死亡[2]。 近年来，随着现代医学技术的飞速发展，AL 的治疗方案不断更新， 治疗效果也明显提高，初诊AL 的缓解率也较前提高。 但在实际的临床工作中，仍有部分患者缓解后还会复发。 目前的研究认为，完成治疗后， 患者体内微小残留病 （minimal-residual disease，MRD）的存在是AL 复发的主要因素[3]。检测AL 患者MRD对于判断预后，指导治疗具有重要意义[4]。 目前，国内多主张应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测骨髓样本的MRD，但骨髓穿刺创伤性大，且取得的标本仅能反应该部分骨髓的状况[5]。 该研究对 2016 年 1 月—2018 年 6 月期间收治的136 例AL 患者应用FCM 检测外周血MRD，以探讨AL 患者应用FCM 进行外周血细胞检测的临床意义。 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择该院血液科收治的AL 患者136 例，所有患者均符合WHO 制定的AL 诊断及分型标准[6]；且初次诊断为AL，并排除急性早幼粒细胞白血病和其他血液系统疾病，均无白血病史， 无其它恶性肿瘤及心肝肾严重器质性疾病， 入组前未接受白血病的相关治疗。 急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者 74 例，男 41 例，女 33例，年龄 24～67 岁，平均（41.8±9.2）岁；急性淋巴白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）62 例， 男 35 例， 女 27例，年龄 22～68 岁，平均（40.5±8.7）岁。 所有入选研究对象对该研究均知情同意，并签署协议书。

1.2 方法

AML 组接受 MA 或 HA 化疗方案 （米托蒽醌/高三尖杉酯碱联合阿糖胞苷） 诱导缓解；ALL 组接受VDLP 化疗方案（长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）诱导缓解，所有受试者均化疗结束后3 d 内抽取上午空腹静脉血4 mL，EDTA-2K 抗凝，分别置入由异硫氰酸荧光素、多甲藻叶绿素蛋白、藻红蛋白、别藻青蛋白免疫标记的试管内进行免疫分型检测， 每个试管均加入有核细胞100万个，根据患者的病变特点选择合适的单克隆抗体。 收集不少于10 万个有核细胞进行分析， 应用EPICS-ALTRA型流式细胞仪进行细胞收集，应用BECKMAN-COULTER公司提供的配套软件分析。 依据原始细胞抗原的表达情况（表达跨系与否、同步与否、强弱情况、是否丢失）判定是否MRD，MRD 含量≥0.01%则判断为阳性，＜0.01%判断为阴性。 对所有受试者进行骨髓穿刺，抽取骨髓液涂片8张，吉姆萨-瑞氏染色，显微镜下分类200 个细胞，根据形态进行分类计数，如原始、幼稚淋巴细胞占骨髓有核细胞的百分比＞5%时则判定为复发[6]。

以骨髓细胞学形态改变（增生1 级或2 级；原始细胞数量增加≥20%）作为MRD 诊断的金标准，评价FCM 检测对MRD 的诊断效能。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件分析统计数据，该研究主要数据为计数资料， 以百分率表示，FCM 检测的MRD 阳性和阴性患者复发率的比较采用校正χ2检验， P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FCM 外周血检测对MRD 的诊断效能

所有AL 患者中骨髓像检测MRD 阳性92 例，其中阴性 AML 患者 49 例，ALL 患者 43 例，FCM 检测对 AML 患者MRD 的诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、 准确度分别为 98.0%、52.0%、80.0%、92.9%、82.4%；对ALL 患者MRD 的诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、 准确度分别为 93.0%、63.2%、85.1%、80.0%、83.8。 见表 1、表 2。

表1 FCM 检测AML 患者MRD 的诊断情况Table 1 MRD diagnosis of AML patients detected by FCM

表2 FCM 检测ALL 患者MRD 的诊断情况Table 2 MRD diagnosis of ALL patients detected by FCM

2.2 AL 患者MRD 阳性与复发率的关系

对 AL 患者随访 1 年，AML 组、ALL 组 MRD 阳性患者复发率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 阴性患者 （32.0%、26.3%），差异有统计学意义（P<0.05）。 见表 3。

表3 AL 患者复发情况（%）Table 3 Recurrence of AL patients

3 讨论

AL 患者是威胁人类健康的造血系统恶性肿瘤， 近年来随着医疗水平的飞速提高和药物研究不断深入， 该病首次化疗缓解率明显提高， 绝大多数白血病细胞经过诱导治疗后能够被杀死，但仍难以达到彻底清除的高度，仍有部分患者化疗缓解后复发[7]。 MRD 的存在是AL 患者复发的关键因素， 化疗后检测MRD 水平对于评价疗效、预后判断均具有重要意义。目前，骨髓细胞形态学检测是AL诊断的金标准，也是疗效评价的常用指标，但骨髓穿刺取得的标本仅反映该区域的骨髓情况， 且当患者体内白血病细胞含量超过1%才能检测出来[8]。 虽然骨髓穿刺液中含有较高比例的白血病细胞 ， 但骨髓穿刺过程往往会发生血液稀释并导致MRD 测定值降低，血液科医师可能过低估计患者的MRD 水平，并可能由此导致临床决策的失误。 近年来的研究发现，AML 患者化疗后白血病细胞在骨骼中的分布存在一定异质性，因此，骨髓液MRD 检测为阴性也有可能是骨髓穿刺未穿到白血病细胞驻留的部位所致[9]。

AL 患者MRD 在外周血中会有所体现， 采集外周血进行MRD 检测可全面反映AL 患者的预后， 且外周血标本获取方便，创伤小，患者容易接受；检测时干扰细胞少，分析MRD 异常免疫表型会更准确。FCM 是一种综合了电子学、细胞免疫学、细胞化学等多种学科技术的细胞检测方法，具有检测方便、速度快、敏感度和特异性高等优势，可在细胞水平辨认白血病细胞的大小、颗粒和荧光特征，对AL 患者外周血中MRD 细胞进行相对和绝对计数，是检测 AL 患者 MRD 的理想手段[10-11]。 Zeijlemaker 等[12]研究也认为应用FCM 计数进行外周血MRD 检测可能替代骨髓液检测，成为评价AML 患者化疗后复发情况的有效方法。 有关学者[13]的研究对比分析了AL 患者外周血和骨髓液中的MRD 水平，发现不同病理类型、不同化疗方案患者上述测定值可能会发生变化， 但二者会保持一定的比例关系。 另有研究[14]也认为ALL 患者外周血和骨髓MRD检测有较好的一致性，外周血MRD 检测可用于ALL 患者预后的评价。 尽管AL 患者（尤其AML 患者）化疗后白血病细胞在全身骨骼分布中存在异质性，但只要MRD 细胞由骨髓释放入血液，都可通过FCM 计数检测出。

该研究结果显示，AML 组、ALL 组 MRD 阳性患者复发率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 阴性患者 （32.0%、26.3%）（P<0.05），与 Zeijlemaker 等报道相似：诱导治疗 1年后的累计复发率，PB mrd 阴性患者为29%，PB mrd 阳性患者为 89% (P<0.001)。 mrd 阴性患者 3 年 OS 为 52%，mrd 阳性患者 3 年 OS 为 15% (P=0.034)。 有研究[15]检测了115 例 AML 患者外周血 MRD 情况， 发现外周血 MRD 测定值较高的AML 患者长期预后相对较差。 该研究也发现MRD 阳性表达的AML、ALL 患者， 其复发率也显著高于同组的MRD 阴性表达患者， 表明MRD 阳性可能与骨髓中白血病细胞的存在有密切关系， 但该研究随访时间较短，至随访结束仍有部分MRD 阳性患者骨髓细胞形态检测未找到复发的充足依据。 到目前为止得出的实验数据已提示MRD 阳性的AL 患者存在高复发风险，MRD 是反应AL 患者预后的重要因素。相关研究也发现MRD 水平＞0.01%的AL 患者， 其3 年复发率是＜0.01%患者的3 倍以上，并认为化疗后MRD 检测持续阴性可停止治疗，如持续阳性则考虑进一步治疗。

综上所述，FCM 诊断外周血MRD 具有较高的敏感性和准确度，在AL 患者化疗后复发的评价中具有较高的临床价值。