肺结核并发糖尿病患者临床特征及淋巴细胞亚群检测结果分析

梁建琴 白雪娟 王金河 陈志 郭东霖 吴雪琼

WHO[1]《2019年全球结核病报告》估算，2018年我国新发结核病患者例数接近86.6万例，3.88万例死于结核病。我国糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者快速增加，糖尿病并发肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)高达22%，居结核病高负担国家之首，并有逐年上升趋势，对人类健康构成巨大威胁[2]。

DM患者容易罹患结核病，除了与感染的结核分枝杆菌的数量和毒力以及DM患者的代谢状态有关外，是否与免疫功能变化有关，是近年来关注的热点。文献报道高血糖或胰岛功能下降直接或间接影响巨噬细胞和淋巴细胞功能[3]。总结分析肺结核并发糖尿病(PTB-DM)患者的临床特征及患者外周血淋巴细胞亚群水平，对了解DM患者PTB发病机制、演变、预后及指导临床免疫治疗有重要意义，现报道如下。

对象和方法

一、 研究对象

回顾性收集2018年4月1日至2019年5月31日在解放军总医院第八医学中心结核二科住院的符合纳入标准的肺结核患者181例，年龄14～89岁，中位年龄47岁。根据是否并发DM将其分为两组：PTB-DM组85例，年龄20～86岁，中位年龄55岁；单纯PTB(以下称PTB组)96例，年龄15～76岁，中位年龄32岁。

二、 纳入标准

DM诊断符合 2019年美国糖尿病协会(ADA)制定的诊断标准[4]。 PTB诊断符合中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会颁布的《WS 288—2017肺结核诊断》[5]。PTB初治、复治定义符合《WS 196—2017结核病分类》[6]。

三、 排除标准

两组患者排除标准：(1)精神分裂患者；(2)恶性肿瘤患者(包括白血病)；(3)器官移植包括干细胞移植患者；(4)伴有自身免疫疾病患者；(5)HIV感染或艾滋病(AIDS)患者；(6)并发支气管哮喘和正在使用糖皮质激素的患者；(7)并发曲霉菌感染患者；(8)严重心肝、肾功能障碍或衰竭患者；(9)妊娠和哺乳期妇女；(10)重度营养不良患者。

四、研究方法

1.淋巴细胞亚群检测方法及15个检测项目：采用美国BD公司FACS流式细胞仪、试剂和数据分析软件Diva，按照说明书检测外周血淋巴细胞亚群，包括15个项目：总T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞(NK细胞)百分比、NK样T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+、双阳性T淋巴细胞百分比、双阴性T淋巴细胞百分比、总B淋巴细胞百分比、总T淋巴细胞绝对计数、CD4+T淋巴细胞绝对计数、CD8+T淋巴细胞绝对计数、NK细胞绝对计数、NK样T淋巴细胞绝对计数、总B淋巴细胞绝对计数。

2.结核分枝杆菌特异性反应T细胞检测方法及结果判读：标本采集、检测方法及结果判读均按照上海铭源数康生物芯片有限公司“结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫斑点法)”使用说明书实施，斑点数<15个为阴性，≥15个为阳性。

五、统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，对两组患者的性别、年龄、治疗史、胸部CT扫描征象和结核分枝杆菌特异性反应T细胞计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。对两组15项淋巴细胞亚群计数的比较，先采用Kolmogorov-Smirnovhe Shapiro-Wilk进行正态性检验，以P<0.05为差异有统计学意义；符合偏态分布，采用“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”表示，采用两独立样本比较的非参数Z检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 临床特征

对两组研究对象进行性别、年龄、治疗史、是否有空洞和病变范围等临床特征进行比较。结果显示，两组患者均为男性多于女性，但PTB-DM组男性明显占优势，PTB组女性明显多于PTB-DM组(χ2=7.42，P=0.006)；两组患者年龄多集中在25～60岁，PTB组<25岁的患者明显多于PTB-DM组，>60岁的患者明显少于PTB-DM组(χ2=23.55，P=0.000)。在<25岁的PTB-DM组有2例 1型DM，1例20岁，1例21岁，均为女性患者；PTB-DM组初治和复治患者分别占74.1%(63/85)和25.9%(22/85)，PTB组分别占84.4%(81/96)和15.6%(15/96)，差异无统计学意义(χ2=2.92，P=0.088)。PTB-DM组胸部CT扫描显示有空洞和病变范围≥3个肺叶的患者明显多于PTB组(χ2=16.56，P=0.000；χ2=9.20，P=0.002)。见表1。

二、 淋巴细胞亚群

对85例PTB-DM患者和96例PTB患者外周血6项淋巴细胞亚群绝对计数进行比较，结果显示差异均无统计学意义(P>0.05)。但6项淋巴细胞亚群计数结果的中位数值的趋势显示PTB-DM组均低于PTB组。以总T淋巴细胞绝对计数和总B淋巴细胞绝对计数的中位数值降低明显。见表2。

三、 结核分枝杆菌特异性反应T细胞

96例PTB组中，7例未检测结核分枝杆菌特异性反应T细胞，其余89例中，结果阳性66例(74.2%)，阴性23例(25.8%)；85例PTB-DM组中，5例未检测结核分枝杆菌特异性反应T细胞，其余80例中，结果阳性65例(81.3%)，阴性15例(18.8%)；差异无统计学意义(χ2=1.22，P=0.270)。

讨 论

DM和PTB是临床常见病, 在患者中两者常并存并且密切关联，相互影响[2]。DM患者PTB的患病率高出正常人的3倍以上[7-8]。目前普遍认为，DM患者的高血糖可作为结核分枝杆菌良好的培养基、肺部微血管病变可导致血氧交换受累使得局部微环境呈酸性，以及DM所致糖、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢紊乱，均有利于结核分枝杆菌定植、生长和繁殖[9]。另外，董斯佳等[10]的研究结果显示，细胞因子白细胞介素(IL)-10的1082位点AA基因型和C-A单倍型与DM并发PTB易感性有关。但高血糖是否导致免疫功能受损使陈旧性结核病或潜伏性结核感染再激活导致结核病发病尚不清楚[7]。

表1 PTB-DM和PTB两组研究对象临床特征比较

表2 淋巴细胞亚群绝对计数结果在两组研究对象中的比较

本研究首先对85例PTB-DM和96例PTB患者进行了年龄、性别、治疗史和肺部CT特征的分析比较，结果提示PTB-DM组的复治患者多于PTB组，提示DM可能是影响PTB复发和难治的原因之一，但是差异无统计学意义，需要扩大样本量进一步研究。而两组患者在性别、年龄、胸部CT扫描有无空洞和病变范围比较，差异有统计学意义。PTB-DM多发生在中老年男性，25岁以下PTB-DM在该研究中只有2例，都是1型DM。因此，应注重对中老年男性PTB患者进行血糖筛查，及时发现DM，有利于抗结核药品治疗方案的调整和预后评估。本研究显示，PTB-DM的胸部CT扫描特征同以往的研究[11-13]一样，空洞的发生率及病变范围大于3个肺叶的患者，其发生率明显高于单纯的PTB患者。反映了PTB-DM患者病情较PTB患者病情严重，传染性强，对社会及家庭危害较大，应加强对PTB患者血糖监测，以及在DM患者中行PTB的快速筛查。

外周血T细胞中95%左右为T细胞受体(TCR)α/β肽链T细胞，是参与特异性细胞免疫的主要细胞。而CD4-CD8-双阴性细胞多数为TCRγ/δ肽链 T细胞，只占外周血T细胞的2%～7%，主要分布于皮肤和黏膜，可识别多种病原体表达的共同抗原成分(非肽类分子)，无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制性。主要功能是抗感染、抗肿瘤、杀伤受感染的靶细胞和肿瘤细胞，参与免疫调节和介导炎症反应。研究表明[14]，双阴性T淋巴细胞表面Toll样受体是天然免疫的重要调节器，其介导的活化信号在适应性免疫起始阶段可能起辅助作用。另外，结核分枝杆菌感染后，CD4-CD8-双阴性TCRγ/δ肽链 T细胞能快速产生IL-17，通过上调炎症因子和招募中心粒细胞、单核细胞趋化等发挥促炎作用，还可协同活化T细胞，连接先天免疫和适应性免疫应答。有文献报道，DM患者对结核分枝杆菌天然免疫应答受损，随后出现超反应性适应性免疫应答。其中NK细胞和Treg细胞以及产生的细胞因子γ干扰素 (IFN-γ)、 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素家族成员等起了关键性作用[15-17]。本研究对85例PTB-DM和96例PTB患者进行了6项淋巴细胞亚群绝对计数的比较分析，结果提示两组差异均无统计学意义(P>0.05)。但从表2结果可以看出， PTB-DM组6项淋巴细胞绝对计数中位数值均低于PTB组，尤其是总T和总B淋巴细胞绝对计数降低较明显，差异虽无统计学意义，但总体趋势提示PTB-DM组的免疫功能还是有所降低。需要加大样本量，进一步开展前瞻性病例对照研究证实。

另外，双阴性T淋巴细胞具有免疫抑制功能并能诱导耐受，抑制CD8+T细胞和CD4+T细胞功能以预防体内过度亢进的细胞免疫应答所造成的免疫损伤。活动性PTB患者双阴性T淋巴细胞减少使机体免疫抑制功能降低，以提高结核分枝杆菌清除能力[14]。本研究没有检测双阴性T淋巴细胞的绝对计数，将是下一步研究的方向。

本研究检测的淋巴细胞亚群指标两组比较差异均无统计学意义。与石文卉等[18]报道一致，与Kumar 和Babu[7]和陆恩词和朱颖蔚[9]报道不一致。分析原因：一方面可能因为本研究没有设单纯DM对照、缺少治疗前后的比较，存在一定的局限性和偏倚；更重要一方面因为结核病免疫错综复杂，影响因素较多，检测结果不仅与病变特征、治疗经过有关联，还与研究对象纳入及排除标准是否严格有密切关系。本研究两组患者排除标准限定严格，除了结核病和DM外，尽可能排除影响免疫功能的其他并发疾病，可能是与其他研究结果不一致的原因之一。

虽然两组患者淋巴细胞亚群的检测指标差异无统计学意义，但是PTB组的所有6项淋巴细胞亚群绝对计数值，包括总T淋巴细胞绝对计数、CD4+T淋巴细胞绝对计数、CD8+T淋巴细胞绝对计数、NK细胞绝对计数、NK样T淋巴细胞绝对计数、总B淋巴细胞绝对计数均高于PTB-DM组，说明PTB-DM较PTB患者无论细胞免疫还是体液免疫均受到一定程度抑制，提示对PTB-DM患者在治疗上应加强免疫支持。下一步将扩大样本量，严格研究设计，对DM的分型及病程等进行分层分析，检测多种细胞因子，进一步明确DM与免疫水平之间的关系，得出更加科学的、有指导意义的结论用于指导临床。

γ干扰素释放试验(IGRA)是近年来结核病免疫学诊断的重要技术，可检测患者外周血IFN-γ水平的变化来判断有无结核感染；本研究采用酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)技术检测外周血结核分枝杆菌特异性反应T细胞。虽然IGRA是一项诊断技术，不能作为判断病情轻重和预后的指标，但为了了解DM是否影响PTB患者外周血T淋巴细胞的致敏和活化，抑制干扰素的产生与释放，本研究对89例PTB和80例PTB-DM患者的外周血结核特异性反应T细胞进行比较，结果显示差异无统计学意义。

DM与结核病的密切关系，以及两者的相互作用已经成为临床和基础研究的重点问题。结核病的严重程度增加了患DM的风险，DM控制不理想将严重影响PTB的疗效及转归，已构成严重的公共卫生问题[19]。更深入研究DM患者结核病易感性的免疫机制，有助于制定合理的治疗策略，减轻社会和患者的双重负担。