结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价

马晓光 石洁 徐行勇 朱岩昆 王少华 郑丹薇 孙国清 孙定勇 苏茹月

目前临床上结核病病原学诊断仍依赖于传统的抗酸染色及分枝杆菌培养方法。众所周知，抗酸染色诊断敏感度低，在病原学确诊的结核病患者中仅达到21.8%[1]。分枝杆菌培养虽然敏感度较抗酸染色有所提高，但仍要求样本中至少含有100个分枝杆菌，分枝杆菌的培养耗时长，一般需要4～6周的时间。液体培养较传统罗氏培养有所改进，但仍需1～3周的时间[2]。此外，抗酸染色、分枝杆菌培养均不能区分是结核分枝杆菌复合群感染还是非结核分枝杆菌感染。

近年来，核酸扩增的方法对结核分枝杆菌进行分子诊断成为了传统诊断方法的重要补充。核酸扩增方法以其快速、灵敏并能鉴定到种等优势备受关注，成为结核病诊断研究的新方向。美国食品及药物管理局(Food And Drug Administration, FDA)已推荐使用PCR用于呼吸道样本中结核分枝杆菌的快速诊断[3]。目前，国内外许多临床机构已经将PCR技术应用于结核分枝杆菌的快速检测。但是PCR检测技术所需仪器昂贵，大大提高了检测成本，并且实验人员需要经过专业培训，这大大限制了其在基层单位以及我国中西部偏远地区的推广应用。

聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction，PSR)是一种基于BstDNA 聚合酶的热稳定性、链置换功能开发的新兴恒温扩增核酸技术。其主要是利用混合引物设计思路，通过解链、引物结合、延伸、再次解链、单链旋转、再次延伸的循环实现恒温条件下核酸扩增的目的。同传统PCR技术相比，PSR由于在恒温条件下反应，摆脱了反应的热循环过程，不需要精准的变温设备，使其检测成本较低。其次，由于其引物同环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)相比，PSR引物设计相对简单，仅需要2条引物即可实现核酸扩增，同时具备较高扩增效率，可实时检测等优势已广泛应用于食品或临床样本中铜绿假单胞菌、沙门菌、白色念珠菌等细菌和真菌的检测[4-6]，也有学者开发了基于逆转录酶的一步法将PSR反应应用于检测甲型H1N1、猪圆环病毒等[7-8]。但对结核分枝杆菌的快速诊断目前未见文章发表。PSR技术作为2015年文献报道的一项新型的恒温扩增技术[9]，目前反应体系和反应条件已经成熟，应用该技术检测不同病原体关键在于设计合适的引物序列进行特异有效的扩增。本研究委托广州迪澳生物有限公司设计并筛选结核分枝杆菌的快速诊断，笔者应用该技术对200例临床诊断结核病患者痰标本进行效果评估。

材料和方法

一、材料与设备

1.试剂：DNA提取液(广州迪澳生物科技有限公司)；RM2×反应液(广州迪澳生物科技有限公司)；BstDNA聚合酶(美国NEB公司)；SYTO 9荧光染料[宝生物工程(大连)有限公司]。

2.细菌及来源：结核分枝杆菌CMCC93009(中国医学细菌保藏管理中心)、鸟分枝杆菌95001、胞内分枝杆菌95002、蟾蜍分枝杆菌95003、土地分枝杆菌95005、堪萨斯分枝杆菌95013、亚洲分枝杆菌95016、瘰疬分枝杆菌95017、龟分枝杆菌脓肿亚种95021、偶发分枝杆菌95022、耻垢分枝杆菌95023、草分枝杆菌95024均购自中国食品药品检定研究所。巴西诺卡氏CGMCC41128、北京棒杆菌CGMCC1727均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。肺炎链球菌购自中国医学细菌保藏管理中心，嗜肺军团菌ATCC33153购自广州呼吸疾病研究所。

3.主要设备：实时荧光定量PCR仪(QuantStudioTM6, 美国ABI公司)，电泳仪(GE 100, 杭州伯乐生物科技有限公司)，凝胶成像分析仪(GEL Doc EQ，美国Bio-Rad公司)。

二、引物设计及合成

本研究从美国国家生物信息中心(NCBI)数据库中选取结核分枝杆菌IS6110基因GenBank:Y17220.1)并进行序列比对[10]，获得结核分枝杆菌基因保守区域。根据PSR反应扩增原理进行引物设计。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

三、样品处理方法

痰液样本中加入1～2倍体积的4%NaOH溶液后涡旋振荡混匀，静置15 min，取1 ml加入带螺旋盖的离心管中，以10 000×g离心5 min，弃去上清液；加入100 μl的DNA提取液，100 ℃加热10 min，加热后迅速冷却(至-20 ℃冰箱)10 min；10 000×g离心2 min，将上清液转移至新的离心管中备用，其中2 μl上清液用于核酸扩增。

四、PSR检测方法的建立

将引物IS 6110-Ft/IS 6110-Bt分别稀释至200 μmol/L 并按照一定比例混合使其终浓度为40 μmol/L。本研究所使用的反应体系为25 μl，具体反应体系为RM2×反应液12.5 μl[包括20.0 mmol/L KCl，40.0 mmol/L Tris-HCl，0.2%Triton X-100，1.6 mol/L甜菜碱，20.0 mmol/L (NH4)2SO4，16.0 mmol/L MgSO4，2.8 mmol/L dNTP]，8U BstDNA聚合酶，SYTO 9(0.5 μl)，引物混合液1 μl，DNA模板2 μl，双蒸水补齐至25 μl，在荧光定量PCR仪上于63 ℃反应45 min。通过荧光信号进行检测和结果判读，若呈现出明显的“S”型扩增曲线，表明该方法可有效扩增结核分枝杆菌。显色法检测结果时，将扩增反应后的体系中加入1×的SYBR Green Ⅰ，若反应体系由橙色变为荧光绿，表明有扩增产物的产生，若颜色不变表明无扩增产物存在。电泳法检测结果时，将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳后观察结果，如含有结核分枝杆菌的扩增产物可呈现出明显的阶梯条带。同时使用结核分枝杆菌和15种非结核分枝杆菌对该方法进行检测特异性评价。

五、最低检出限评价

将初始浓度为107菌落形成单位(CFU)/ml的结核分枝杆菌CMCC93009菌悬液采用10倍稀释法将其浓度依次稀释至106、105、104、103、102、10 CFU/ml。将上述不同浓度的1 ml菌液样本以10 000×g离心5 min，弃去上清液。加入100 μl的DNA提取液，100 ℃加热10 min，加热后迅速冷却(至于-20 ℃冰箱)10 min，10 000×g离心2 min，将上清液转移至新的离心管中备用，其中2 μl上清液用于核酸扩增。运用实时荧光定量PCR仪进行检测，每个浓度的样本检测3次，以确定其检出下限。

六、痰涂片抗酸染色显微镜检及固体痰培养

于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份)，对痰标本进行痰涂片抗酸染色镜检和分离培养。按照《结核病实验室检验规程》中的要求对收集的痰标本进行痰涂片、抗酸染色和显微镜检操作；萋-尼染色液购自珠海贝索公司。采用固体罗氏培养法进行分离培养。将患者痰液用4%氢氧化钠消化后，涡旋振荡混匀，静置15 min后，用无菌一次性吸管接种于改良酸性罗氏培养基上。37 ℃条件下进行培养，第3天和第7天各观察1次，此后每周观察一次并记录生长过程，培养至菌落生长或8周后报告无菌落生长。采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)生长试验进行菌种鉴定。对生长菌落进行萋-尼染色，确认是否为抗酸杆菌。改良酸性罗氏培养基购自珠海贝索公司。200例患者中痰涂片染色镜检检测阳性48例，阳性检出率为24.0%(48/200)；痰培养检测阳性83例，阳性检出率为41.5%(83/200)，经菌种鉴定均为结核分枝杆菌。

七、统计学处理

以痰培养结果为参照，计算PSR检测结核病的敏感度、特异度，使用Kappa值评估该方法与痰培养的一致率。Kappa值≤0.4为一致性较差；0.4

结 果

一、PSR检测结核分枝杆菌方法的建立

设计引物对结核分枝杆菌CMCC93009进行PSR扩增反应，结果如图1所示，虽然对于结核分枝杆菌实时荧光定量显示其呈现出明显的“S”型扩增曲线，但阴性对照和其他非结核分枝杆菌同样存在非特异性扩增，因此需对引物进行序列优化。

经对引物序列进行优化筛选，最终筛选出能特异性检测结核分枝杆菌的引物IS 6110-Ft和IS 6110-Bt(表1)，并用其检测结核分枝杆菌CMCC93009，实时荧光定量显示其呈现出明显的“S”型扩增曲线，而阴性对照无非特异性扩增(图2)。显色法结果显示有扩增产物的产生；而阴性对照无(图3)。电泳法结果显示有扩增产物的产生；而阴性对照组无扩增条带(图4)。

图1 聚合酶螺旋反应进行结核分枝杆菌检测时引起的非特异性扩增

图2 聚合酶螺旋反应进行结核分枝杆菌检测(实时荧光定量法)

NC：阴性对照；PC：扩增产物图3 聚合酶螺旋反应进行结核分枝杆菌检测(显色法)

M：marker分子量梯度；NC：阴性对照；PC：扩增产物图4 聚合酶螺旋反应进行结核分枝杆菌检测(凝胶电泳法)

检测特异性评价结果显示，只有含结核分枝杆菌样本表现为阳性扩增曲线，而含其余15种非结核分枝杆菌的样本均无扩增曲线的出现，最终重合成一条线(图5)。

图5 聚合酶螺旋反应对结核分枝杆菌的检测特异性分析

图6 聚合酶螺旋反应检测结核分枝杆菌最低检出限分析

表1 结核分枝杆菌复合群IS6110引物序列

二、最低检出限分析

最低检出限分析检测结果显示菌液浓度为103～106CFU/ml，在3次重复实验中均可稳定检出，而浓度为102CFU/ml时3次重复检测仅有1次可检出(图6)。因此，该方法检测结核分枝杆菌最低检出限为103CFU/ml。

三、PSR检测结核病患者效能评价

PSR检测结核病患者阳性87例，阳性检出率为43.5%(87/200)，高于传统痰涂片染色镜检技术[24.0%(48/200)]和痰培养[41.5%(83/200)]。以痰培养结果为参照，PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117)，阳性预测值为92.0%(80/87)，阴性预测值为97.3%(110/113)，Kappa值为0.898(表2)。表明该方法与痰培养检测方法基本一致。

讨 论

对于结核病这类传染性疾病而言，结核分枝杆菌的快速诊断对于结核病的筛查及早期的隔离治疗具有十分重要的意义。目前，国内对结核分枝杆菌的检测技术主要包括细菌学检测、免疫诊断、PCR和实时荧光定量PCR等方法。这些方法在特异度、敏感度及检测周期等方面存在一定的不足，因此，建立操作简单，快速便捷的结核分枝杆菌诊断技术对于结核病的防控尤为重要。核酸恒温扩增技术，如LAMP、重组酶聚合酶扩增技术、交叉引物扩增技术及PSR技术等由于不需要精准的变温设备，具有较高的敏感度等优势已在临床诊断中广泛应用，而PSR技术应用于结核分枝杆菌的快速检测报道相对较少[11-13]。本研究针对结核分枝杆菌特异性基因IS 6110插入序列设计PSR扩增引物，可通过实时荧光法、电泳法及显色法判读反应结果，说明LAMP法结果判读方式同样适用于PSR产物检测[14]。而使用显色法(SYBR Green Ⅰ)及电泳法会因实验过程中反复开盖造成气溶胶污染，导致假阳性出现，同时因电泳法耗时较长，操作复杂等缺陷导致其临床应用价值较低。实验证实，在反应体系中添加SYTO 9荧光染料可实现闭管实时结果判读，克服上述2种判读方式的缺陷。本实验中利用实时荧光PSR技术建立的结核分枝杆菌检测体系结合相应的DNA提取试剂可在1.5 h内对完成靶标进行检测，同时最低检测限可达到103CFU/ml。此外，本研究结果表明与15种常见的非结核分枝杆菌无交叉反应。而以涂片结合罗氏固体培养为金标准的方法对从痰样本处理到结果报告约需40 d，耗时较长，可能会对患者病情造成延误。PSR检测技术有效缩短了诊断时间，且最新版《WS 288—2017 肺结核诊断》明确增加了分子生物学检测结果可作为临床确诊的依据。

表2 以痰培养结果为参照评价PSR检测的效能

PSR检测周期短，仅需1.5 h即可完成结核分枝杆菌的快速诊断。相关研究表明痰涂片镜检法检测限为5×103～5×104CFU/ml, 固体培养法的检测限为100 CFU/ml[12]。根据目前200份临床样本检测的数据表明，该方法的阳性检出率为43.5%，高于痰涂片技术。以传统痰培养结果为参照，PSR检测结核病的敏感度为96.4%, 特异度为94.0%，表明其具有较高的敏感度与特异度，并且该方法与传统痰培养的Kappa一致性系数为0.898，显示出较好的检测性能。此外，有研究结果表明LAMP技术在结核分枝杆菌临床样本中检测的敏感度及特异度分别为91%及97%[15]。说明本研究中的PSR检测结核病的敏感度及特异度和LAMP技术十分接近。此外，PSR检测的阳性预测值及阴性预测值分别高达92.0%及97.3%，这提示PSR检测为阳性者结核分枝杆菌感染的可能性极高，而检测为阴性者结核分枝杆菌感染的可能性极低，故PSR检测方法适合应用于结核分枝杆菌的初筛。

综上，以IS 6110为检测靶标构建的PSR检测方法具有敏感度高、特异度佳的特点，且具有快速便捷、不需要复杂的仪器设备、适用范围广等优势，有助于早期快速筛查结核病患者；期待在未来基于PSR技术开发的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒能够为结核病的防控与检测提供有力的技术支撑。