支链氨基酸生物合成及其生产菌的研究进展

陈志超,刘云鹏,徐庆阳,陈 宁

(天津科技大学 生物工程学院,天津 300457)

支链氨基酸(BCAAs),即L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸,是哺乳动物体内不可合成的必需氨基酸[1],对其生理功能和代谢具有重要作用。BCAAs用于食品、药品和化妆品中,是抗生素和除草剂的前体,在饲料添加剂中也有广泛应用[2]。与其他氨基酸一样,BCAAs也是由诱变或代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或大肠杆菌(Escherichiacoli)发酵而成[3-4]。

化学法生产BCAAs,需要经过化学衍生、色谱分离和酶处理对映体等步骤,除考虑合成工艺条件外,还要考虑异构体的拆分与D-异构体的消旋利用,多重因素导致化学法生产支链氨基酸成本高、难度大。随着对BCAAs需求的增加,对生产成本与生产效率的要求随之提高,发酵法因经济性、环境友好性、产物纯度高和产量大等优势而备受关注。早期,大多数BCAAs生产菌株是通过随机诱变分离得到的,但是随机诱变方法将遗传变异分布在基因组的各个部位,使有益突变很难筛选,遗传性状不稳定,导致产量和糖酸转化率很难提高。代谢工程育种是指以生物化学和遗传学为基础,研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制,通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的基因工程菌株,从而人为使有用产物选择性大量合成积累。近年来,人们通过合理的基因工程技术培育出了产氨基酸菌株,例如通过过表达目标氨基酸的合成基因。系统代谢工程在基因组水平分析代谢流[5],能帮助研究人员优化碳通量向目标氨基酸合成[6]。与经典诱变育种相比,代谢工程育种可以通过针对性的菌株改造来获得目的产物,大大提高了育种效率与产量。笔者综述了BCAAs的生物合成途径及其在微生物中的调控作用,特别是谷氨酸棒杆菌,它是放线菌科的一种非致病性革兰氏阳性菌,广泛用于氨基酸和核苷酸的工业化生产,也概述了用于生产BCAAs的微生物菌株的发展。

1 支链氨基酸合成调控

1.1 乙酰乳酸合酶与苏氨酸脱氢酶

乙酰乳酸合酶(乙酰羟基酸合酶,AHAS)由ilvBN编码,是支链氨基酸合成的第一个关键酶。AHAS能催化生成2-乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸,它们分别是L-亮氨酸/L-缬氨酸和L-异亮氨酸的间接前体物,该反应的起始原料为丙酮酸和2-酮丁酸。丙酮酸由糖酵解(EMP)途径提供,2-酮丁酸由L-苏氨酸通过ilvA编码的苏氨酸脱氢酶(TDH)合成,TDH受到L-异亮氨酸反馈抑制[7],而L-缬氨酸可以恢复TDH的活性[8]。AHAS由大亚基和小亚基组成,分别由ilvB和ilvN编码,AHAS的小亚基负责所有3种BCAAs的多价调控[9]。与C.glutamicum不同,有些细菌有几种AHAS的亚型,例如,大肠杆菌有3个同工酶AHAS Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ,分别由ilvBN,ilvGM和ilvIH编码[2]。这些基因的表达受到不同的调控,所有BCAAs均能减弱ilvGM,而ilvBN仅受L-亮氨酸和L-缬氨酸的影响[10]。L-缬氨酸对AHAS Ⅰ、Ⅲ活性有较强的抑制作用,L-异亮氨酸对其活性的抑制作用较弱,L-亮氨酸对其活性无影响[11]。大肠杆菌对L-缬氨酸非常敏感,在极低浓度下生长受到抑制,谷氨酸棒杆菌合成支链氨基酸的途径为

1.2 乙酰羟基酸异构还原酶

在C.glutamicum中,ilvC基因编码乙酰羟基酸异构还原酶(AHAIR),与ilvBN基因受到同一操纵子转录调控。AHAIR利用NADPH作为辅助因子,将2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸以合成L-缬氨酸和L-亮氨酸,将2-乙酰-2-羟基丁酸转化为2,3-二羟基-3-甲基戊酸以合成L-异亮氨酸,ilvBNC操纵子的表达受BCAAs转录弱化调控[12]。

1.3 二羟基酸脱水酶

ilvD编码的二羟基酸脱水酶(DHAD)[13]能将2,3-二羟基异戊酸、2,3-二羟基-3-甲基戊酸分别催化生成2-酮异戊酸、2-酮-3-甲基戊酸,DHAD被L-缬氨酸或L-亮氨酸抑制[14],ilvD基因的转录调控机制尚不清楚。

1.4 支链氨基酸转氨酶

ilvE编码的支链氨基酸转氨酶(BCAT)或转氨酶B是L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成的最后一个酶[13],该酶将L-谷氨酸的氨基转移到2-酮异戊酸酯和2-酮-3-甲基戊酸,分别生成L-缬氨酸和L-异亮氨酸[15]。

L-亮氨酸的特异性合成途径是从leuA编码的异丙基苹果酸合成酶(IPMS)反应开始,由2-酮异戊酸和乙酰CoA生成2-异丙基苹果酸,该酶在C.glutamicum中受L-亮氨酸反馈抑制,其表达也受L-亮氨酸调控[16],随后,异丙基苹果酸异构酶(IPMI)将2-异丙基苹果酸异构化为3-异丙基苹果酸,IPMI由大亚基和小亚基组成,分别由leuC和leuD编码,由leuB编码的异丙基苹果酸脱氢酶(IPMD)将3-异丙基苹果酸转化为2-酮-4-甲基戊酸。在C.glutamicum中,leuB受L-亮氨酸反馈抑制,leuABCD基因在大肠杆菌中形成操纵子,其表达受L-亮氨酸介导的转录弱化调控[17]。L-亮氨酸与另外两种BCAAs一样,是由2-酮-4-甲基戊酸在BCAT的催化作用下形成的[18],此外,该步反应也可由tyrB编码的酪氨酸可抑制转氨酶(TrAT)催化[10]。

2 生产支链氨基酸的代谢工程菌种现状

通过合理的育种策略设计,有目的地利用代谢工程手段改造代谢网络,设计菌株的分解代谢与合成代谢的多步级联反应,能最大限度提高支链氨基酸的产量,减少副产物的生成,避免诱变育种对菌体的不良影响[19]。发酵法生产化学品的一般策略是“进、通、节、堵、出”[20],发酵法生产支链氨基酸也采用这一策略。

2.1 L-缬氨酸

生产L-缬氨酸的微生物最早由Udaka等[21]和Sugisaki[22]报道。Udaka和Kinoshita筛选了大量的微生物,筛选出的细菌即Paracolobacterumcoliforme和Brevibacteriumammoniagenes,由葡萄糖生产L-缬氨酸的摩尔产率为23%;Sugisaki分离了Aerobactercloacae和A.aerogenes,由葡萄糖生产L-缬氨酸的摩尔产率为20%,以L-缬氨酸为例,详细介绍了“进、通、节、堵、出”[20]育种策略中的“进、通、节、出”。

2.1.1 进

在ΔaceE菌株生长阶段,乙酸通过DeoR型调控因子SugR抑制磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS),阻止菌株吸收葡萄糖[23-25],因此乙酸的添加能抑制L-缬氨酸的产生。Blombach等[26]删除了sugR基因以消除对PTS基因的抑制作用。sugR基因缺失菌株消耗葡萄糖速率比亲本菌株快5倍,甚至在生长阶段,在存在乙酸的情况下,依然能产生L-缬氨酸,尽管总体产量降低了40%。用乙醇代替乙酸作为次生碳源还可以避免PTS基因受到抑制。C.glutamicumΔaceEΔpqoΔsugR(pJC4ilvBNCE)在其成长阶段也能产生L-缬氨酸,这些菌株是L-缬氨酸的高效生产菌,积累了14～26 mmol/LL-丙氨酸和丙酮酸,调节NADPH的供应策略可以减少这些副产物的积累。

在缺氧条件下,大多数葡萄糖将用于C.glutamicum的产物生成,而不是菌株生长。Hasegawa等[27]使用了缺失ldhA基因的菌株,发酵主要在缺氧条件下进行,ldhA基因编码乳酸脱氢酶,用于乳酸的生产。单纯过表达L-缬氨酸生物合成ilvBNCDE基因,由于氧化还原力失衡导致葡萄糖摄取不良,不能有效生产L-缬氨酸。通过诱变使AHAIR(ilvCTM)的辅因子由NADPH转化为NADH,并利用质粒pCRB-DLD引入NADH依赖型的外源性亮氨酸脱氢酶取代NADPH依赖的内源性BCAT,解决了这一问题。此外,解除反馈抑制的AHAS(ilvBNGE)突变体也被过表达。菌株C.glutamicumRΔldhA(pCRB-BNGECTM,pCRB-DLD)发酵24 h能生产1 470 mmol/LL-缬氨酸,摩尔产率在63%,48 hL-缬氨酸的产量达到1 940 mmol/L,该菌株的主要副产物为琥珀酸[27]。为了减少琥珀酸的碳代谢流,敲除了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc,琥珀酸生产受到抑制,导致NADH/NAD+比值升高。通过缺失ctfA,pta和ackA3个基因改善细胞内氧化还原失衡。这3个基因与乙酸合成有关,乙酸合成会产生过量的NADH。过表达5个EMP基因gapA，pyk，pfkA，pgi和tpi,敲除avtA可以抑制L-丙氨酸的生成。最终菌株C.glutamicumRilvNGECTM，gapA，pyk，pfkA，pgi，tpiΔldhAΔppcΔptaΔackAΔctfAΔavtA(pCRB-BNGECTMpCRB-DLD)以葡萄糖为底物,分批补料发酵24 h,能生产1 280 mmol/LL-缬氨酸,摩尔产率达到88%。

2.1.2 通

Radmacher等[13]构建了C.glutamicumΔilvAΔpanB,通过质粒过表达ilvBNCD/ilvBNCE增强L-缬氨酸的合成,其中菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB(pJC1ilvBNCD)发酵48 h能积累92 mmol/L的L-缬氨酸以及少量的L-丙氨酸,约1.3 mmol/L。尽管此菌株的AHAS不能解除L-缬氨酸的反馈抑制,但它产生L-缬氨酸的效率已经得到提升。这是因为L-缬氨酸对C.glutamicum的AHAS的反馈抑制作用不强,对酶活性的最大抑制作用不超过50%[9]。研究者进一步探究了对AHAS解反馈抑制,将AHAS调控亚基(ilvN)原基因替换为具有反馈抗性的突变体ilvNM13,该突变体是基于对E.coli和Streptomycescinnamonensis具有反馈抗性的同源基因结构信息而设计的。无质粒的菌株发酵48 h,能生产90 mmol/LL-缬氨酸,而出发菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB只能生产不到40 mmol/L的L-缬氨酸。该株菌通过质粒过表达ilvBNC增强L-缬氨酸合成,由此而来的菌株C.glutamicumΔilvAΔpanBilvNM13(pECKAilvBNC)生产L-缬氨酸能达到130 mmol/L。基因ilvN的突变对L-缬氨酸的产量影响不大,其亲本菌株C.glutamicumΔilvAΔpanB(pECKAilvBNC)能积累高达120 mmol/L的L-缬氨酸。

可以通过调节启动子强弱来调节代谢途径基因表达的策略,代替完全缺失侧通路基因或强过表达合成目标产物的限速酶。Holátko等[28]构建了C.glutamicumilvNM13 ΔpanBP-ilvAM1CG P-ilvDM7 P-ilvEM6,ilvA通过变异的启动子表达下调,ilvD和ilvE表达上调。该菌株经过48 h摇瓶发酵产生136 mmol/L的L-缬氨酸。启动子强度的调节可以不通过外源质粒而过表达基因,这确保了基因的稳定性,也不需要抗生素标记。由于菌株不需要额外的营养补充,因此缓养性是有利的。

Blombach等报道了一种以缺失基因ilvA和panB生产L-缬氨酸的替代策略。编码PDHC E1p亚基的aceE的缺失导致菌体无法仅依靠葡萄糖生长,额外补充乙酸可以使菌体生长[29]。Blombach等[30]研究了该菌株发酵过程中有机酸和氨基酸的积累,发现在乙酸耗尽后,该菌株开始产生丙酮酸(30～35 mmol/L)、L-丙氨酸(25～30 mmol/L)和L-缬氨酸(30～35 mmol/L)。丙酮酸的积累是PDHC失活的直接结果,丙酮酸是L-丙氨酸和L-缬氨酸的前体物。通过质粒过表达ilvBNCE,工程菌C.glutamicumΔaceE(pJC4ilvBNCE)以葡萄糖及5 mmol/L丙酮酸为底物,补料发酵，能生产210 mmol/L的L-缬氨酸,摩尔产率为50%,该菌株不需要补充L-异亮氨酸或D-泛酸,优于上述ΔilvAΔpanB菌株。

Blombach等[31]对aceE缺失菌株C.glutamicumΔaceE(pJC4ilvBNCE)进行了进一步的改造,敲除了编码丙酮酸醌氧化还原酶(PQO)的pqo基因,该菌株的摩尔产率增加了30%。当细胞密度较高时,PQO与乙酸激酶和磷酸转乙酰酶结合可能绕过PDHC反应,提供乙酰CoA,因此,PQO失活,切断了生长碳代谢流供应,促使L-缬氨酸产量增加。研究者持续检测C.glutamicumΔaceEΔpqo(pJC4ilvBNCE)培养基中丙酮酸含量,结果表明L-缬氨酸生产受到丙酮酸—L-缬氨酸下游反应限制。在从葡萄糖到L-缬氨酸的总反应中,下游反应(丙酮酸—L-缬氨酸)需要两分子NADPH,同时BCAT需要消耗L-谷氨酸,而EMP途径只提供NADH不提供NADPH。为了弥补L-缬氨酸生产中NADPH供应不足,删除基因pgi,使葡萄糖中的碳代谢流直接进入磷酸戊糖途径,由1 mol葡萄糖生成2 mol NADPH。最终,C.glutamicumΔaceEΔpqoΔpgi(pJC4ilvBNCE)以葡萄糖为底物生产超过400 mmol/L的L-缬氨酸,摩尔产率为75%,未检测到丙酮酸残留。从碳代谢流角度来看,删除pyc编码的丙酮酸羧化酶也是有益的,C.glutamicumΔaceEΔpqoΔpgiΔpyc(pJC4ilvBNCE)的摩尔产率达到了86%,L-缬氨酸浓度约为240 mmol/L。

2.1.3 节

在L-缬氨酸生产菌株中,副产物L-丙氨酸的形成是一个普遍存在的问题[32],因此抑制L-丙氨酸的合成有利于L-缬氨酸的生产。alaT和avtA两个基因编码丙氨酸氨基转移酶,分别以L-谷氨酸或L-缬氨酸作为氨基供体,将丙酮酸转化为丙氨酸[30]。在菌株C.glutamicumΔilvAΔpanBC(pJC1ilvBNCD)中敲除alaT和avtA中任意一个基因,基本不会影响L-缬氨酸的生产。avtA缺失突变体仅表现为L-丙氨酸积累的微弱下降,而alaT缺失突变体则有了较大的改善,与亲本菌株相比,L-丙氨酸的生成从1.2 mmol/L下降到0.16 mmol/L。

在以E.coliATCC4157为出发菌分离产氨基酸微生物时,发现了一个氨基酸类似物耐受型突变菌株可以积累L-缬氨酸[33]。该L-缬氨酸生产菌源于一株缬氨酸耐药菌,该菌株经过进一步突变获得L-亮氨酸营养缺陷,最终这一突变菌能产生超过2 g/L的L-缬氨酸。诱变Serratiamarcescens也获得了一个氨基酸类似物耐药性突变菌[34]。通过几种支链氨基酸结构类似物筛选测试,得到的α-氨基丁酸(α-AB)耐受突变菌能够积累超过8 g/L的L-缬氨酸。酶分析表明:在这些突变体中,AHAS仅受到微弱的反馈抑制。3个L-谷氨酸生产菌,即B.lactofermentum,C.acetoacidphilum和Arthrobactercitreus,诱变后经组氨酸类似物2-噻唑丙氨酸筛选,获得生产菌[35]。产量最高的菌株为B.lactofermentum突变株,72 h的L-缬氨酸产量为31 g/L,该菌株的AHAS解除了由L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸引起的反馈抑制,此外,该酶的表达部分解除了反馈阻遏[36]。一个有趣的例子是生物素缺陷型B.flavumMJ-233的α-氨基丁酸耐受突变株,当培养基中缺乏生物素且细菌停止生长时,碳代谢流转向L-缬氨酸的产生[37]。以葡萄糖为底物,使用该菌株发酵,能积累300 mmol/L的L-缬氨酸,其摩尔产率为80%,纯度为总氨基酸的96%。

Hou报道了一株混合策略的菌株[38],其ilvA的表达受到突变弱启动子的调控,缺失avtA抑制了L-丙氨酸的产生。过表达解除反馈抑制的L-缬氨酸合成基因的菌株C.glutamicumMPilvAΔavtA(pDXW-8-ilvEBNrC),能生产266 mmol/L的L-缬氨酸,摩尔收率在27%。副产物如L-乳酸和L-谷氨酸是通过保持15%饱和度溶氧(DO)来控制的。将相同的策略应用于B.flavumJV16,这是一个由B.flavumDSM20411随机诱变产生的α-ABr,Leu-Ile-Met-菌株。B.flavumJV16avtA::Cm(pDXW-8-ilvEBNrC)以葡萄糖为原料,能生产331 mmol/L的L-缬氨酸,摩尔产率为39%。还有另一个使用C.glutamicum亚种生产L-缬氨酸的例子[39],B.flavumATCC14067pDXW-8-ilvEBNrC,以葡萄糖为原料,在高达37 ℃的培养温度下,经48 h补料分批发酵,能生产325 mmol/L的L-缬氨酸,摩尔产率为37%。

Westbrook等[40]报道了利用CRISPR-Cas9改造Bacillussubtilis以生产L-缬氨酸。通过解除转录和变构调节,与野生菌株相比,L-缬氨酸浓度增加14倍。随后研究者确定并消除了限制L-缬氨酸过量生产的因素,增加丙酮酸的供应和阻断L-亮氨酸和L-异亮氨酸生物合成途径。通过失活编码E1α丙酮酸脱氢酶复合体亚基的pdhA基因,增加细胞内丙酮酸浓度;失活分别编码IPMS和TDH的leuA和ilvA基因,废除另外两种支链氨基酸合成途径,经摇瓶培养L-缬氨酸达到4.61 g/L。L-缬氨酸生产菌B.subtilis不含质粒,失活了编码特异性芽孢转录因子σF的基因sigF使其不能形成芽孢,使该菌能用于大规模生产L-缬氨酸。

2.1.4 出

Chen等[41]从C.glutamicumATCC13869中制备了一株ilvA,aceE和alaT均缺失的菌株,以尽可能多地由丙酮酸得到L-缬氨酸。过度表达了编码BCAA输出蛋白的brnF和brnE基因,以及编码整体调控因子Lrp的lrp基因,Lrp除了激活L-缬氨酸生物合成基因(ilvBNC)外,还激活了brnFE的表达。工程菌株C.glutamicumATCC13869ΔaceEΔalaTΔilvA(pJYW-4-ilvBNC1-lrp1-brnFE)在分批补料发酵96 h能生产435 mmol/L的L-缬氨酸。

与C.glutamicum相比,产L-缬氨酸E.coli菌株的开发相对滞后,这可能是由L-缬氨酸的生物合成调控机制较为复杂所致。以E.coli为基础菌株具有生长速度快、遗传信息丰富等优点。早期的菌株包括获得解除反馈抑制的AHASIII菌株[42]或过表达编码L-缬氨酸输出蛋白的ygaZH的菌株[43]。Ile-tRNA合成酶突变株[44]和硫辛酸缺陷型H+-ATP合酶失活突变株[45]可以积累L-缬氨酸。这些菌株是通过经典的随机突变筛选得到的,它们的基因型无法确定。

2.2 L-异亮氨酸

Hayashibe等[46]最先报道L-异亮氨酸生产菌,在研究苏氨酸代谢时,分离的耐受α-AB的B.subtilisNo.14能生产4.3 g/L的L-异亮氨酸。通过α-AB筛选的产L-异亮氨酸的菌株,有A.aerogenesIAM1019(2.4 g/L),PseudomonasaureofaciensIAM1001(3.0 g/L),S.marcescens(2.7 g/L),ErwiniacarotovoraE30(1.3 g/L)。另外,D-苏氨酸作为天然氨基酸对映体用于筛选Serratia和Pseudomonas属微生物[47],其中效果最好的菌株S.marcescensNo.1培养40 h能产生8 g/L以上的L-异亮氨酸。大多数的L-异亮氨酸生产菌通过BCAA结构类似物筛选得到[48],通过硫代异亮氨酸筛选的有E.coli[49-50],Salmonellatyphimurium[48,51],Saccharomycescerevisiae[52],五亚甲基甘氨酸筛选的有S.typhimurium[51],甘氨酰异亮氨酸筛选的有E.coli[48],异亮氨酸氧肟酸筛选的有S.marcescens[53],酮毒素筛选的有Bacillussubtilis[54]。

通过理性的代谢工程来提高L-异亮氨酸的产量,必须解决L-异亮氨酸的生物合成途径与L-缬氨酸和L-亮氨酸合成途径共同基因和酶的问题,将前体物都转向到L-异亮氨酸的合成上。苏氨酸是L-异亮氨酸生物合成的前体物之一,消除TDH的反馈抑制是高效生产L-异亮氨酸的关键。

生产L-异亮氨酸需要供应L-苏氨酸。因此,笔者将简要概述L-苏氨酸的生物合成途径及其调控。L-苏氨酸的生物合成始于L-天冬氨酸,该途径由5个酶反应组成[55],分别由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶催化。E.coli的天冬氨酸激酶同工酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ分别由thrA,metL和lysC编码,而C.glutamicum只有一个天冬氨酸激酶由lysC编码。E.coli天冬氨酸激酶I和III分别受L-苏氨酸和L-赖氨酸反馈抑制,而天冬氨酸激酶II不受反馈抑制的影响。E.coli的天冬氨酸激酶II是由L-蛋氨酸通过metBL操纵子来调控的[56],C.glutamicum天冬氨酸激酶同时受到L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制[7]。

由于L-苏氨酸的生物合成途径与L-赖氨酸的生物合成途径有重要的共同之处,因此在生产L-异亮氨酸时,利用产L-赖氨酸菌株选育产L-苏氨酸菌株是可行的。Colon等[57]报道了使用L-赖氨酸生产菌株ATCC21799过表达野生型ilvA,积累了114 mmol/LL-异亮氨酸。Morbach等[7,58]对另外一个L-赖氨酸生产菌株C.glutamicum进行随机突变,同时在染色体中引入了多个解反馈抑制的hom和thrB的拷贝,或者用反馈抑制脱敏基因替换了染色体本身的lysC和hom基因,同时过表达ilvA,前者在补料分批发酵产生96 mmol/LL-异亮氨酸,后者在补料分批发酵产生138 mmol/LL-异亮氨酸。hom的过表达只有在ilvA过表达后才可能有效,否则L-苏氨酸和L-高丝氨酸的积累会导致菌株不稳定[59]。Yin等[60]从L-异亮氨酸生产菌株C.glutamicumJHI3-156中鉴定了TDH和AHAS的反馈抗性突变体。当这两种反馈抗性酶在同一菌株中过表达时,该菌株在补料分批条件下能产生234 mmol/LL-异亮氨酸,对该菌株进行蛋白质组学分析进一步确定了表达上调和下调的蛋白,这些蛋白与细胞生长、L-异亮氨酸生物合成和应激反应有关[61]。

引入外源基因也是一种有效的策略。例如,将源于大肠杆菌的ilvA基因引入生产L-苏氨酸的B.flavum菌株中,产生153 mmol/LL-异亮氨酸[62]。Wang等[63]将来源于E.colik-12的thrABC基因导入,敲除alaT,得到的菌株产生了100 mmol/LL-异亮氨酸和低浓度的L-赖氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸。Guillouet等[64]报道了编码E.coli代谢途径TDH的tdcB基因较有反馈抗性的ilvA更具优势。表达了tdcB基因的菌株积累的L-异亮氨酸是ilvA基因的4倍,在分批发酵中产生了30 mmol/L的L-异亮氨酸[65]。

与L-缬氨酸一样,输出蛋白对于L-异亮氨酸的高效生产也很重要。因此,在C.glutamicumJHI3-156中过表达整体调控因子Lrp和BCAA输出蛋白BrnFE,生产205 mmol/LL-异亮氨酸[66]。Zhao等[67]通过对C.glutamicumIWJ001改造提高L-异亮氨酸产量,该菌株经随机诱变筛选的产生L-异亮氨酸的菌株。研究表明:分别过表达编码核糖体延伸因子G和核糖体循环因子的fusA和frr基因时,L-异亮氨酸生物合成的酶显著上调。同时过表达ilvA,ilvB,ilvN和ppnk(一种多磷酸/依赖于ATP的NAD激酶),该菌株在72 h的补料分批发酵中产生了217 mmol/LL-异亮氨酸。

发酵条件的优化也是一个需要解决的问题。Peng等[68]利用C.glutamicumJHI3-156优化了发酵条件的DO和pH,最终在分批培养中获得203 mML-异亮氨酸;Hashiguchi等[69]通过将带有ilvA,ilvGM,ilvD和ilvE基因的质粒引入产生L-苏氨酸的K-12突变体,加强了下游反应,得到的菌株能生产78 mmol/LL-异亮氨酸,该菌株也能产少量L-缬氨酸,但通过引入反馈抗性的天冬氨酸激酶III基因,成功地降低了L-缬氨酸的产量,并将L-异亮氨酸的最终浓度提高到94 mmol/L[70]。

2.3 L-亮氨酸

在经典的例子中,通过α-AB筛选的S.marcescens回复突变株,能积累L-亮氨酸[71]。研究[71-72]表明,耐受α-AB能解除L-异亮氨酸,L-缬氨酸和L-亮氨酸生物合成的酶反馈抑制。L-异亮氨酸营养缺陷的回复突变体的TDH未解除反馈抑制,对IPMS反馈抑制脱敏,使得L-亮氨酸的过量生产。

另一个产生L-亮氨酸的突变菌株是从谷氨酸生产菌B.lactofermentum中获得的[73]。以2-噻唑丙氨酸为筛选标记,得到L-蛋氨酸/L-异亮氨酸双缺陷型的B.lactofermentum2256,优化培养条件,可生产30 g/LL-亮氨酸[74-75]。在该菌株中,IPMS解除了反馈抑制和反馈阻遏,AHAS未发生变化[34]。使用β-羟基亮氨酸进行筛选,获得了AHAS对所有的BCAAs都脱敏[76]。这些菌株L-亮氨酸的产量为34 g/L。进一步使用高浓度的D-α-氨基丁酸筛选,分离得到活性较高的AHAS和IPMS突变菌株[77]。该突变株产生更多的L-亮氨酸,并且L-亮氨酸/L-缬氨酸比例比亲本菌株更高。

E.coli的突变菌株已被开发用于L-亮氨酸生产。筛选4-硫唑嘌呤亮氨酸耐药性的E.coliK-12菌株,解除亮氨酸对IPMS反馈抑制,其中产量最高的菌株可产生5.2 g/L亮氨酸[17]。对ilvE突变,分离得到L-异亮氨酸/L-缬氨酸双缺陷型的突变菌[78],通过外源质粒使其过表达tyrB,tyrB只作用于L-亮氨酸的生物合成。结果菌株产生2.7 g/LL-亮氨酸,没有检测到L-缬氨酸/L-异亮氨酸。降低编码α-酮戊二酸脱氢酶sucAB基因的启动子活性可以减少碳代谢流进入三羧酸循环(TCA),降低乙酰CoA的消耗[79],将该菌株与反馈抑制脱敏的IPMS和失活BCAT相结合,最终L-亮氨酸达到11.4 g/L。

从氨基酸营养缺陷型菌株中也能获得L-亮氨酸生产菌株。其中以L-苯丙氨酸和L-组氨酸双缺陷型菌株产量最高,其L-亮氨酸累积量为16.0 g/L,耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸的C.glutamicum突变菌株可用于生产L-亮氨酸[80],但该菌株遗传性状不稳定。

稀有密码子的翻译依赖于其相应的稀有tRNA,在氨基酸缺乏的情况下,这些tRNA不能被完全结合。理论上,由于缺乏携带氨基酸的稀有tRNA而导致的翻译中断或延迟,可以通过喂养或细胞内合成相应的氨基酸来部分恢复。受这一假设的启发,Zheng等[81]开发了一个筛选或选择系统,通过在选定的报告蛋白或耐药标记的编码序列中用相应的稀有密码子替换目标氨基酸的普通密码子,获得目标氨基酸的过量生产者。结果表明:随机突变库中成功地选择了高产L-亮氨酸菌株LP-4,L-亮氨酸达到18.55 mg/g生物量,是野生型菌种的2.91倍,该策略为获得和了解氨基酸生产过剩菌株提供了新的思路。

Vogt等[82]报道了一株基因型明确L-亮氨酸生产菌株。该菌株的染色体中含有3份Ptuf-leuAB018模块拷贝。基因leuAB018,编码IPMS,解除L-亮氨酸的反馈抑制。在本模块中,天然启动子被强启动子tuf取代,不受转录弱化的影响,通过将gltA(编码柠檬酸合酶)的天然启动子替换为较弱势启动子PdapA-L1,增加了IPMS酶反应的另一个底物乙酰CoA的供应。为了提高L-亮氨酸生物合成的下游基因leuBCD的表达,敲除转录阻遏蛋白编码基因ltbR。AHAS调控位点(ilvN编码)引入突变,使其解除反馈抑制,增加碳代谢流向L-亮氨酸生产。IolT1受IolR调控,通过独立的PTS催化葡萄糖的摄取,因此,iolR基因也被删除,以增强葡萄糖的摄取,该菌株补料分批发酵72 h能生产高达181 mmol/LL-亮氨酸。

Feng等[83]理性设计了C.glutamicumFA-1,通过优化转氨酶来提高L-亮氨酸的产量。菌株C.glutamicumFA-1ΔilvE在不添加亮氨酸的情况下仍表现出明显的生长,C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspB则不能。C.glutamicumFA-1ΔilvEpEC-XK99E-aspB,L-亮氨酸能积累(20.81±0.02) g/L,L-缬氨酸浓度显著降低,说明aspB也参与了L-亮氨酸的生物合成。随后,克隆了芳香氨基转移酶TyrB和推测的天冬氨酸氨基转移酶aspC,yhdR,ywfG基因产物,通过外源质粒在C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspB表达,只有C.glutamicumFA-1ΔilvEΔaspBpEC-XK99E-tyrB能够合成L-亮氨酸,L-亮氨酸产量为(18.55±0.42) g/L。克隆并表达了两个推测的支链转氨酶基因ybgE和CaIlvE,这两种基因在BCAAs生物合成中都发挥着高效的作用。

Wang等[84]通过提高氧化还原通量来提高L-亮氨酸的产量。为改变细胞内氧化还原状态,对ilvC编码的AHAIR突变,插入来源于Lysinibacillussphaericus的leuDH基因编码的依赖于NAD的亮氨酸脱氢酶,来源于Bacillussubtilis的rocG基因编码的谷氨酸脱氢酶,分别代替天然的BCAT和谷氨酸脱氢酶。菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRM/ABNCME与菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRMLeuDH/ABNCMLDH相比,L-亮氨酸积累量相近,但后者L-缬氨酸积累降低,从8.06 g/L降低到2.72 g/L,说明LeuDH对L-亮氨酸的合成具有较强的特异性,但对L-缬氨酸的合成无特异性。最终菌株C.glutamicumXQ-9ΔLtbR-AHAIRMLeuDH RocG/ABNCMLDH累积了(23.31±0.24) g/LL-亮氨酸,糖酸转化效率为19.1%。

目前,基于生物信息学的碳通量模拟研究,正逐渐成为理性设计的有力工具,以最大化提升生产目标化合物的生物合成途径的效率[85-86],这些技术的应用将是人们创造更复杂更有价值微生物菌株的重要手段。

3 结 论

我国采用发酵法生产支链氨基酸已有多年历史,但遗憾的是,与国际先进水平相比,我国支链氨基酸生产存在产酸低、周期长、副产物多、纯度低、提取困难、经济性差和生产过程污染严重等问题。解决上述问题对我国支链氨基酸产业化与药品、轻工化妆品、食品添加剂和饲料添加剂等行业的发展具有重要的意义。对BCAAs的生物合成途径及其调控机制进行了概括,并对用于BCAAs生产的微生物菌株进行了综述,对利用先进的分子生物学技术合理设计产生BCAAs的菌株具有指导意义。