多黏类芽孢杆菌微生物絮凝剂的制备及其性能试验研究

李梦茜，龙洁云，蔡承儒，张振旺

(1.河池学院 化学与生物工程学院，广西 宜州 546300；2.湖北科技学院 医药研究院，湖北 咸宁 437100)

无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和天然絮凝剂等都在工业领域有广泛应用。聚丙烯酰胺等有机高分子絮凝剂价格低廉且絮凝效果较好，但其中有些不容易降解，有些降解后的单体可能对环境有不利影响。微生物絮凝剂具有生物降解性，且降解中间体对环境无害[1]。蛋白质絮凝剂[2-3]、多糖絮凝剂[4-12]、糖蛋白絮凝剂[13-20]，以及由枯草芽孢杆菌生产的聚谷氨酸[21-25]和黄单胞菌生产的黄原胶[26-27]等均具有絮凝活性，可以作为无害生物聚合物絮凝剂。试验分离出一株芽孢杆菌L2019-1，其可以产生生物高分子絮凝剂，研究了该微生物絮凝剂的絮凝活性，确定了其化学组成。

1 试验部分

1.1 芽孢杆菌L2019-1的筛选

采用琼脂平板培养法，以高岭土悬浮液为絮凝对象，以LB为基础培养基，从宜州污水处理厂污泥样品中分离出一株芽孢杆菌L2019-1。观察菌落形态、显微细胞形态，分析菌株的生理生化特征，测定16S rRNA序列，确定芽孢杆菌L2019-1的种属类别。

1.2 微生物絮凝剂的制备

在30 ℃、120 r/min搅拌条件下，将芽孢杆菌L2019-1置于含1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物的基础培养基(pH=7.0)中，于摇床中振荡培养48 h。培养后，用NaOH溶液将发酵液pH提高到11.5，搅拌20 min，使细胞表面絮凝剂溶出；然后在12 000 r/min条件下将黏稠发酵液离心15 min，之后在上清液中加入2倍体积的冷乙醇沉淀絮凝剂，于8 000 r/min条件下离心10 min后收集絮凝剂并溶于蒸馏水中。经过3次乙醇沉淀后在蒸馏水中透析和冻干，得到微生物絮凝剂粗品。絮凝剂粗品中含有蛋白质，采用Sevag法去除后，得到较纯的微生物絮凝剂。

1.3 絮凝活性测定

用高岭土悬浮液对微生物絮凝剂纯品测定絮凝活性。将0.2 mL微生物絮凝剂溶液、9.4 mL质量浓度4 g/L高岭土悬浮液和0.4 mL的CaCl2溶液加入到离心管中，混合后用涡流混合器搅拌混合并静置10 min。从离心管上层取0.2 mL上清液，加入到96孔板中，在550 nm(B)波长处测定吸光度。用同样方式对不含絮凝剂的溶液进行对照试验，测定550 nm(A)波长处的吸光度。絮凝活性计算公式为

式中：μ—絮凝率，%；A—对照上清液吸光度；B—加入絮凝剂后上清液吸光度。

用同样方法考察絮凝剂在活性炭、纤维素和酵母悬浮液中(550 nm处的吸光度调为1.4)的絮凝活性。酵母悬浮液用面包酵母制备。

1.4 微生物絮凝剂的成分分析

以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量。以半乳糖醛酸为标准，采用硫酸咔唑法测定糖醛酸含量。以氨基葡萄糖为标准，采用Morgan-Elson法测定氨基糖含量。以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质。

采用高效液相色谱法测定絮凝剂纯品的单糖组成：冻干样品2 mg在浓度3 mol/L盐酸溶液中,于100 ℃下水解4 h，氮吹仪吹干。水解后干燥得到的单糖样品中加入浓度为0.5 mol/L的1-苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和浓度为0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，混合充分后，于70 ℃水浴中反应30 min。之后冷却至室温，加入0.3 mol/L盐酸溶液0.5 mL，混合充分后再加入0.5 mL氯仿，剧烈振荡萃取。离心分相后用0.22 μm滤膜过滤后进行分析。絮凝剂分子质量采用凝胶层析法测定，用日本岛津色谱柱，流速为1.0 mL/min，以浓度为0.1 mol/L的NaCl溶液为溶剂，以蓝色葡聚糖分子质量为标准。

2 试验结果与讨论

2.1 菌株筛选与鉴定

经固体平板划线分离，从污泥中分离出的菌株为芽孢杆菌L2019-1。菌液对高岭土悬浊液的絮凝率为72%，且絮凝性稳定。

2.2 L2019-1菌株的形态与理化特征

L2019-1菌在LB固体培养基上呈乳白色圆形半透明菌落，表面光滑，呈椭圆杆状，有黏性(图1)。采用VITEK全自动微生物检测系统分析其理化性质，结果见表1。可以看出，L2019-1菌株形态和理化特征与芽孢杆菌属较为一致。

a—菌落形态；b—显微镜下的细胞形态(放大1 000倍)。图1 菌株L2019-1的形态

表1 菌株L2019-1的生化特征

2.3 16S rRNA序列分析

对L2019-1菌株提取总DNA后进行测序，16S rRNA测序结果采用BLAST程序与NCBI数据库中信息进行同源性比对，构建出系统进化树，结果如图2所示。依据比对结果，L2019-1菌株属于多黏类芽孢杆菌。

图2 L2019-1菌株的16S rRNA序列的系统进化树

2.4 絮凝剂的絮凝性能

2.4.1 在高岭土悬浮液中的絮凝性能

在高岭土悬浮液中，此微生物絮凝剂的絮凝活性受其浓度、助凝剂阳离子、反应温度及悬浮液pH的影响。试验条件下，絮凝剂最佳絮凝活性时的质量浓度为30 mg/L左右(如图3所示)。

图3 絮凝剂浓度对絮凝率的影响

高岭土悬浮液中加入阳离子对微生物絮凝剂的絮凝活性有一定影响。以AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl和KCl为阳离子源，图4为微生物絮凝剂在含1 mmol/L阳离子的高岭土悬浮液中的絮凝活性。可以看出：A13+、Fe3+、Ca2+对絮凝剂的絮凝活性有明显刺激作用，能显著提高絮凝活性。

图4 阳离子种类对絮凝剂絮凝率的影响

在含有A13+、Fe3+、Ca2+的高岭土悬浮液中，阳离子质量浓度对絮凝剂絮凝率的影响试验结果如图5所示。

图5 阳离子浓度对絮凝剂絮凝率的影响

由图5看出：絮凝剂的絮凝活性随Ca2+浓度升高而提高；Fe3+、Al3+浓度分别为0.8、0.2 mmol/L时，絮凝剂的絮凝率最佳。由于A13+在低浓度下效果明显，因此，推断Al3+是增强絮凝剂絮凝活性的合适阳离子。推测A13+、Fe3+、Ca2+通过中和稳定碳的剩余负电荷而促进絮凝作用。悬浮液中加入阳离子是诱导微生物絮凝剂有效絮凝活性的充分条件。试验结果与红潮红球菌和杯状假碱菌所制备微生物絮凝剂需添加Ca2+和Al3+才具有较高絮凝活性的要求相一致[28-29]。

体系pH、温度对絮凝剂絮凝率的影响试验结果分别如图6、7所示。

图6 体系pH对絮凝剂絮凝率的影响

图7 温度对絮凝剂絮凝率的影响

由图6、7看出：体系pH=6.0条件下，含0.2 mmol/L Al3+的高岭土悬浮液中，絮凝活性最高；最佳絮凝温度为20～30 ℃。

2.4.2 在活性炭悬浮液中的絮凝活性

活性炭悬浮液中絮凝剂质量浓度对絮凝率的影响试验结果如图8所示。可以看出，该絮凝剂对活性炭悬浮液的最佳絮凝质量浓度为20～30 mg/L。可以认为，该絮凝剂适用于含碳无机废水，如煤泥水的固液分离和净化。

图8 活性炭悬浮液中絮凝剂质量浓度对絮凝率的影响

2.4.3 在纤维素、酵母悬浮液中的絮凝活性

酵母和纤维素悬浮液中絮凝剂质量浓度对絮凝率的影响试验结果如图9所示。可以看出，在纤维素、酵母等有机悬浮液中，絮凝剂的絮凝活性很好：在纤维素悬浮液中，最佳质量浓度为30 mg/L；在酵母悬浮液中，最佳质量浓度为40 mg/L。

图9 酵母和纤维素悬浮液中絮凝剂质量浓度对絮凝率的影响

2.5 絮凝剂的成分

依据文献[3]，微生物絮凝剂的主要化学成分为糖类、多肽、蛋白质、核酸和脂类物质。

絮凝剂粗品由多糖和少量蛋白质组成：根据考马斯亮蓝法，粗品中约含25%蛋白质；苯酚-硫酸法测得其总糖质量分数为74%。

絮凝剂纯品为酸性多糖物质，由醛酸和中性糖组成。根据Morgan-Elson法，其不含氨基糖；依据硫酸咔唑法，其酸性多糖中醛酸质量分数约为18%。

絮凝剂纯品水解后以高效液相色谱法分析单糖种类及质量分数，结果见表2。可以看出，其含有9种单糖，以葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸为主。其凝胶色谱显示只有单峰且分子摩尔质量约为2.4×106g/mol。

表2 单糖种类及质量分数

3 结论

用分离得到的多黏类芽孢杆菌L2019-1可制备高分子絮凝剂。此絮凝剂的絮凝活性受体系中阳离子、体系pH、温度等因素影响。高岭土悬浮液中，Ga2+、Fe3+、Al3+的存在可促进絮凝，最佳pH=6.0，适宜温度30 ℃。该絮凝剂在无机和有机悬浮液中都表现出良好的絮凝活性，所以，有必要继续优化芽孢杆菌L2019-1的培养条件，以用廉价方式获得较高絮凝剂产量。