线虫寄生后柞蚕幼虫脂肪体超微结构观察

贾 姝 赫英姿 于庭洪 赵 翀 左玲玲 宋 策

(辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城 118100)

柞蚕线虫病是柞蚕被索科线虫(Meronithidae)寄生后引起的一种寄生性病害，辽宁省约有12万hm2柞蚕受线虫为害，寄生率达50～60%，给柞蚕生产造成巨大损失[1]。柞蚕幼虫被线虫寄生后，随着线虫的发育蚕体表现为摄食量异常、生长发育迟缓、营养物质含量降低、中肠蛋白酶活性异常等[2]。解剖病蚕可见幼虫肌肉层薄，脂肪体少等病理变化[3]，柞蚕脂肪体是柞蚕重要的物质代谢器官，也是寄生线虫的营养物质和能源供应的来源，采用透射电镜技术，观察线虫侵染后柞蚕脂肪体组织的超微结构病理变化，有助于查明寄生期间柞蚕与寄生线虫的相互关系，为探讨线虫寄生对柞蚕幼虫的致病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种

供试柞蚕品种为抗大，由辽宁省蚕业科学研究所提供。将孵化的柞蚕幼虫放到无线虫分布的麻栎(QuercusacutissimaCarruth.)树上放养，4眠起后移至有线虫分布的柞园内饲养，随降雨幼虫被线虫寄生后再移至无线虫分布的柞园内继续放养。以被线虫寄生的柞蚕为试验组，同龄期健康柞蚕为对照组。

1.2 试剂与仪器

Epon812包埋剂购自Sigma公司。包埋剂的配制：A液[Epon812环氧树脂 6.2 mL、DDSA(十二烷基琥珀酸酐) 10 mL]；B液[Epon812环氧树脂10 mL、MNA(甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐) 8.9 mL]；配制比例A∶B=2∶8，DMP-30(增塑剂)加入总量的1.5%。日立H-7650透射电子显微镜，由沈阳农业大学分析测试中心提供。

1.3 柞蚕幼虫脂肪组织超薄电镜切片样品制备

取线虫寄生第14天的柞蚕幼虫和同龄期健康幼虫，使用体积分数为75%的乙醇对蚕体消毒后在无菌培养皿中解剖，用无菌刀片切取脂肪体组织，用3%戊二醛固定30 min后，再将脂肪体组织切成2 mm×1 mm×1 mm小块继续用3%戊二醛固定4 h，PBS(pH =7.4)漂洗后，1%四氧化锇固定2 h，PBS(pH =7.4)漂洗，乙醇梯度脱水，Epon812包埋，LKB-IV超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色2 h，干燥后于115 kV电压下用日立H-7650透射电子显微镜观察、拍照。

2 结果与分析

线虫寄生后柞蚕幼虫脂肪体、线粒体、细胞核和内质网都发生明显变化。

2.1 脂肪体细胞变化

线虫寄生第14天柞蚕脂肪体(图1A)与健康对照组(图1B)相比变化明显。对照组脂肪体细胞近似球形，数量较多，颜色较深，其内充满脂类物质。而试验组脂肪体细胞形状变小、不规则，数量减少，颜色变浅，推测可能是因为其内脂类物质被分解造成脂肪体细胞干瘪收缩。

2.2 脂肪体细胞线粒体变化

线虫寄生第14天，柞蚕脂肪体细胞线粒体(图1C)呈长椭圆形，基质中未见到明显颗粒体，嵴的数量也明显减少。对照组脂肪体细胞线粒体(图1D)呈长条形，能明显观察到基质内有许多颗粒体，其内嵴均匀排列。健康柞蚕幼虫脂肪体细胞线粒体呈长条形可能是因为受到脂肪体细胞中饱满脂肪球的挤压的原因。

2.3 脂肪体细胞核变化

线虫寄生14天后，试验组幼虫脂肪体细胞核有明显的病变(图1E)，对照组脂肪体细胞核形状饱满呈边缘不规则椭圆形(图1F)，核膜表面平整，染色质相对集中。试验组柞蚕脂肪体多数细胞核解体，少数未裂解的细胞核核膜表面凹凸不平，周围聚集内质网，染色质分布也较为分散。

2.4 脂肪体细胞内质网变化

电镜下观察到在感染线虫第14天，柞蚕脂肪体细胞的粗面内质网超微结构与对照组相比发生了明显变化，健康柞蚕幼虫扁平囊状的粗面内质网分散排列于细胞质中，核糖体附着在粗面内质网外围，颗粒体清晰排布(图1H)。而试验组脂肪体细胞内的粗面型内质网(图1G)肿胀并且排列紧密，周围未观察到核糖体颗粒。

3 结论与讨论

脂肪体是昆虫血淋巴中的薄叶状组织，结构松散，能够与血淋巴充分接触，保证昆虫体内营养物质的及时供应[4]。脂肪体的储存功能是昆虫的生命基础，糖原和甘油三酯是能量储存的主要形式，糖原能够随时降解提供能量，甘油三酯能够通过β-氧化反应分解成脂肪酸提供能量。另外，昆虫的绝大多数中间代谢反应都在脂肪体中发生，比如糖和脂质的代谢，蛋白合成，氨基酸和氮的代谢等[5]。脂肪体除了为昆虫的生命代谢储存营养物质外，还是重要的免疫器官[6-7]，在抵御病原微生物入侵和解毒过程中起着重要作用[8-11,12]。

病原物入侵会破坏昆虫的脂肪体细胞结构，蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum对寄主脂肪体的影响尤为突出，这可能是由于寄主脂肪体中富含大量脂类物质，而某些寄生蜂成虫缺乏脂类合成能力，其成虫阶段所需脂类物质必须由幼虫直接从寄主中获得并积累[13-14]。被嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditisbacteriophora) 感染后的暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)和大黑鳃金龟(H.oblita)2龄幼虫脂肪体和中肠的组织结构表现为脂肪球变形，颜色变浅，脂肪体细胞和中肠细胞内质网肿胀、减少，线粒体肿胀、破裂，中肠微绒毛大量脱落，核内染色质大量解离，核膜破裂[15]。棉铃虫(Helicoverpaarmigera)感染中华卵索线虫(Ovomermissinensis) 后的脂肪体细胞内的线粒体、内质网、脂肪球和细胞核等细胞器在形态和结构上均有较大的病理变化[16]。昆虫的脂肪体分布在体腔内消化道周围，与血淋巴充分接触，便于物质的交换与运输。线虫寄生期间需要从宿主血腔中吸收大量的营养物质，会对血淋巴成分的组成结构产生影响。测定柞蚕5龄幼虫被线虫寄生后其血淋巴营养代谢发现，线虫寄生柞蚕幼虫后造成蚕体血淋巴总糖、海藻糖、甘油酯、蛋白质含量和海藻糖酶活性显著降低，酯酶活性升高等变化[2]。通过透射电镜观察柞蚕脂肪体细胞超微结构发现，被线虫寄生14天后，柞蚕脂肪球变形、颜色变浅，这可能与线虫寄生后柞蚕血淋巴酯酶代谢活性升高，使贮藏于脂肪体中的脂类物质分解有关。当酯酶活性升高时，宿主体内大分子物质被分解成为大量小分子物质，释放进入血淋巴被寄生线虫吸收利用[17]。另外，线虫寄生引起寄主的免疫反应需要大量消耗寄主的能量，并将吸收的脂类物质转化为滋养体，引起脂肪体细胞的“能量加工厂”——线粒体结构的病理变化，嵴的数量减少、颗粒体消失等。这种病理变化，可能是线虫同宿主间的能量竞争的结果，并且这种营养竞争会朝着有利于线虫寄生的方向发展。也可能是在线虫寄生作用下分泌出的特殊物质，引起了柞蚕幼虫脂肪体细胞线粒体形态结构发生改变。线虫寄生后柞蚕脂肪体细胞内质网发生病变，也揭示了寄主蛋白质、脂类和糖类的合成受到影响。寄生线虫消耗寄主营养物质、破坏柞蚕的能量供应系统，影响其他组织的能量供应，使柞蚕正常的生长发育受阻，细胞核裂解，脂肪组织解体及功能缺失加速寄主死亡。

本研究初步明确了线虫寄生后柞蚕脂肪体组织的超微结构病理变化，为探讨线虫对柞蚕幼虫的致病机制提供了组织病理学证据。脂肪体组织也是昆虫的免疫器官，脂肪体组织发生病变也间接说明免疫系统遭到破坏[18]，有必要继续开展线虫寄生对柞蚕免疫系统各项指标的影响研究，以期从免疫学角度揭示线虫对柞蚕的致病机制，为柞蚕的免疫机制研究提供有参考价值的信息。