壮通饮抑制NADPH氧化酶2对糖氧剥夺诱导星形胶质细胞损伤的保护作用

李 岩，覃启京，梁慧荟，麻小梅，何 青，李曼菲，朱 亮，赖思嘉，杨 鹤，王凯华

(广西国际壮医医院，广西 南宁 530201)

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在很多生物体的化学反应中起递氢体的作用，对机体具有重要意义，而NADPH氧化酶(NOX)是细胞内一组具有氧化活性的蛋白，包含NOX1-5，DUOX1-2七种催化亚基。NOX2首先在吞噬细胞内发现，分布在多数器官中，是NOX亚型中分布最广泛的。然而，越来越多的证据显示，NOX2在非吞噬细胞内也有表达，主要包括神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞等[1]。研究证明NOX2是其中影响脑损伤的重要亚型[2-3]，抑制NOX2的表达和活性可以减轻脑缺血再灌注损伤、血脑屏障破坏和脑水肿[4]。

壮医经验方壮通饮主要由扶芳藤、参三七、黄花倒水莲三味广西特色壮药配伍而成，是广西壮族地区民间医生根据壮医理论从疏通人体“三道两路”，调治巧坞(大脑)的角度出发，通过严谨配伍组成的治疗脑梗死的经验方[5]。扶芳藤为卫矛科植物的茎叶，味辛，性平，具有通龙路火路、舒筋脉、止出血、散瘀血的功效。药理学研究显示，预给药后大鼠脑缺血再灌注脑组织中的c-fos含量下降，提示其有减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的作用[6]。急性毒性实验显示，扶芳藤药性平和，毒性较低[7]。参三七是五加科植物的干燥根，是广西民间常用名贵药，味甘，微苦、温，具有除瘀血、通龙路、止血、消肿止痛的功效。药理学研究表明，其能显著降低大鼠脑组织和血液中过氧化脂质的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，具有保护中枢神经系统的作用[5]。毒理研究表明，其剂量过大会出现溶血，停药后可逐渐消失，临床口服无溶血作用，安全可靠[8]。黄花倒水莲为远志科植物的根或全株，味甘，性微温，具有祛湿解毒、补虚消肿、活血止血之功效。现代药理学研究表明，其能显著降低大鼠血清丙二醛含量，提高SOD活性，具有抗氧化、清除自由基等作用[10]；同时能够延长正常小鼠在缺氧和低温状态下的生存时间，具有抗氧化应激作用[11]。毒理学研究表明其毒性很小，小鼠的最大耐受倍数为246～262倍[12]。“三道两路”指“气道”(壮语lohheiq)“谷道”(壮语dungxsaej)“水道”(壮语lohramx)三道和“龙路”“火路”两路。“三道”是人体生命活动的营养物质化生、储藏、输布、运行的场所。龙路的功能主要是为人体各部分输送营养，约束人体内血液的运行，龙路的网络遍布全身，其中枢在心脏，保障龙路的通畅是保证血液正常运行的前提条件。“火路”是人体受到内外刺激后，对刺激做出反应的信号传输通路，相当于现代医学的神经系统。壮医认为人之所以能感知天地之变化，主要为火路之功能，其中枢在“巧坞”(大脑)[13]。本研究应用体外培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞缺糖缺氧模型，观察壮通饮能否通过抑制NOX2对糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation，OGD)导致的星形胶质细胞损伤发挥保护作用。

1 材料与方法

1.1 壮通饮的制备

壮通饮：扶芳藤30 g、参三七10 g、黄花倒水莲25 g。药材去除杂质切制后，按组方剂量配比，加入生药材10倍量的水，浸泡60 min 后，用TC-15 套式恒温器250 V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至150 V，保持微沸状态煎煮1 h，滤取煎液。药渣再加入生药材8倍量的水，同法煎煮1 h，滤取煎液。合并2次煎液，于恒温水浴锅(100 ℃)蒸发去水分至浓稠状，转入恒温烘箱(60 ℃)干燥，得干浸膏，称重，收膏率为36.8%，4 ℃保存，备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为2.0 g/mL。

1.2 动物

出生2天的雌性SD大鼠，SPF级，体重8～12 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(粤)2014-004。饲养环境：室温22～25 ℃，相对湿度60%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 试剂

夹竹桃麻素(Apo，大连美仑，000020170316)，DMEM-F12培养液(美国Gibco，000020170406)，D-Hanks(中国吉诺，000020170321)，胎牛血清(FBS，美国Gibco，000020170312)，胰酶(美国Gibco，000020170325)，兔抗NOX2多克隆抗体(美国Abcam，000020170401)，羊抗鼠IgG抗体(中国博士德，000020170402)，二甲基亚砜(DMSO，美国sigma，000020170315)。

1.4 仪器

CO2培养箱(日本SANYO公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；低温高速离心机(日立，CE16RX Ⅲ)

1.5 方法

本研究参照以往的方法[14]，取出生2天的SD大鼠处死，取脑皮质，HanKs液洗3次，剪碎。①剪碎的组织转入离心管中，加培养液，反复吹打后接种在培养瓶中；②剪碎的组织1 000 rpm离心5 min后取沉淀以0.25%胰酶消化5 min，以含血清的培养液终止消化，1 000 rpm离心5 min，取沉淀以完全培养液重悬并吹打成细胞悬液，接种在培养瓶中。差速黏附30 min后翻转培养瓶继续培养。待较多细胞贴壁后换液，之后2～3天换液1次。培养7～12天长成致密单层细胞后37 ℃摇床振荡18 h，次日以0.25%胰酶消化仍贴壁的细胞以传代，免疫荧光鉴定。

取第四代星形胶质细胞，参照以往的研究方法[15]，弃培养基，用PBS冲洗细胞3次，加入无糖DMEM培养液，培养皿放入厌氧罐(含95% N2和5% CO2)将厌氧罐置于37 ℃细胞培养箱中，缺氧状态下分别培养6 h、12 h、24 h后，更换正常培养液，继续在37 ℃细胞培养箱中培养不同时间(复氧0 h、8 h、24 h)，模拟再灌注。实验分组：①正常对照组：即阴性对照组，细胞不作任何处理；②糖氧剥夺组：单纯糖氧剥夺组中的细胞，不加药物干预，仅在密闭容器内培养6 h、12 h、24 h；③药物组：在进行糖氧剥夺处理前1 h分别加入含壮通饮的培养液(浓度分别为20、40、80 mg·L-1)和夹竹桃麻素(NOX2抑制剂，浓度分别为0.05、0.25、0.5 mg·mL-1)。

1.5.1 星形胶质细胞活性测定 采用CCK-8试剂盒测定，具体步骤参照以往研究方法[16]，细胞存活率(%)=(待测孔吸光度值-空白孔)/(对照组吸光度值-空白孔)×100%，实验重复3次，取平均值。

1.5.2 免疫荧光染色 免疫荧光标记参照以往的研究方法[17-18]。种植在96孔板上的星形胶质细胞用PBS(0.01 mol·L-1，pH=7.4)，轻柔冲洗3次，每次5 min，然后用4%多聚甲醛固定15 min。3%胎牛血清室温封闭30 min。滴加一抗(兔抗GFAP，1∶400)，4 ℃过夜。PBS清洗细胞3次，5 min·次-1，滴加二抗(抗兔的二抗TRITC，1∶800)，避光室温孵育2 h。Hoechst 33258避光染色10 min，清洗细胞2次，于荧光显微镜(ZEISS)下观察并拍照。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志物。

1.5.3 Western Blot检测NOX2蛋白表达 Western Blot参照文献的研究方法[19]。使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA进行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗(兔抗NOX2多克隆抗体，1∶1 000)，4 ℃过夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗小鼠单克隆抗体，1∶3 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤后，用化学发光显色法显影，定影，洗片。用Image J图像处理软件分析条带的灰度值并进行统计分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 星形胶质细胞培养及鉴定

星形胶质细胞在培养第9天分化成熟，形成神经细胞网络结构。GFAP免疫荧光染色显示细胞质呈红色(图3A)，Hoechst 33258染色显示细胞核呈蓝色(图3B)，胞质呈红色的即为星形胶质细胞，细胞纯度>98%(图3C)。

图3 星形胶质细胞免疫荧光染色

2.2 糖氧剥夺对星形胶质细胞活力的影响

缺糖缺氧8 h后，糖氧剥夺组与对照组比较，细胞活力变化没有统计学意义(P>0.05)。缺糖缺氧12 h后，糖氧剥夺组与对照组比较，细胞活力下降，差异有统计学意义(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后，糖氧剥夺组与对照组比较，细胞活力明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后细胞生存率下降最显著，降至(65.91±8.21)%。见表1。

表1 缺糖缺氧8，12，24 h，星形胶质细胞的细胞活力测定结果

2.3 壮通饮对正常星形胶质细胞生长的影响

正常培养8 h后，对照组和不同浓度壮通饮预处理组之间比较，细胞活力没有差异(P>0.05)。正常培养24 h后，壮通饮40 mg·L-1和80 mg·L-1预处理组与对照组比较，细胞活力增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 壮通饮对正常培养星形胶质细胞活力影响的测定结果

2.4 壮通饮对糖氧剥夺后不同时间星形胶质细胞活力的影响

复氧(再灌注)后0 h，糖氧剥夺组和不同浓度壮通饮预处理组之间比较，细胞活力没有差异(P>0.05)。复氧后8 h，壮通饮40 mg·L-1和80 mg·L-1预处理组与糖氧剥夺组比较，细胞活力增强，差异有统计学意义(P<0.05)。复氧后24 h，壮通饮80 mg·L-1预处理组与糖氧剥夺组比较，细胞活力增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 壮通饮对复氧0 h、8 h、24 h星形胶质细胞活力影响的测定结果

2.5 壮通饮及夹竹桃麻素对糖氧剥夺/再灌注诱导的星形胶质细胞损伤中NOX2表达的影响

Western Blot显示，复氧后0 h，糖氧剥夺组星形胶质细胞NOX2表达水平与对照组比较升高，差异有统计学意义(P<0.05)；不同浓度三壮通饮预给药对星形胶质细胞NOX2表达的影响与糖氧剥夺组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。复氧后8 h，糖氧剥夺组星形胶质细胞NOX2表达水平与对照组比较升高，差异有统计学意义(P<0.05)；不同浓度壮通饮预给药组星形胶质细胞NOX2表达水平降低，与糖氧剥夺组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示壮通饮对NOX2表达起抑制作用。夹竹桃麻素是NOX2的抑制剂，糖氧剥夺后复氧0 h、8 h，糖氧剥夺组星形胶质细胞NOX2表达水平与对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。夹竹桃麻素预给药组(0.25 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1)星型胶质细胞NOX2表达水平与糖氧剥夺组比较显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3 讨论

表4 壮通饮及夹竹桃麻素对糖氧剥夺复氧0 h、8 h星形胶质细胞NOX2表达影响的测定结果

脑卒中是危害人类健康最重要的疾病之一，其中缺血性卒中占所有卒中类型的85%，是致残和致死的首要和第二位病因[20]。急性缺血性卒中对脑血流的损害导致了脑缺氧和细胞凋亡。尽早恢复脑血流再通对于急性缺血性卒中患者至关重要。目前恢复血流再通的主要治疗方法是溶栓，但由于治疗时间窗过短及潜在的出血风险极大限制了其在临床中的广泛应用[21]。因此，我们迫切需要针对急性缺血性卒中的新疗法。通过干预脑组织缺血缺氧所引起的一系列生理病理改变，保护缺血引起的神经损伤(即神经保护)，对于缺血性卒中的治疗具有极其重要的意义。目前，很多学者都在尝试研究通过神经保护减轻或逆转脑缺血的药物及其制剂[22]。研究证实壮通饮具有广泛的药理作用，包括扩张血管、抗氧化、抗凝、降低血液黏稠度、降血糖、改善微循环、抑制血栓形成等[23]。本实验结果显示壮通饮能够提高正常培养的星形胶质细胞的细胞活力，对糖氧剥夺/再灌注诱导的细胞损伤具有保护作用。结果显示正常培养24 h，壮通饮能够增强细胞活力，但糖氧剥夺导致细胞活力下降，其中24 h细胞活力下降最明显，说明糖氧剥夺对星形胶质细胞具有损伤作用。而复氧后8 h和24 h，不同浓度的壮通饮分别能够增强糖氧剥夺后的细胞活力，说明壮通饮对糖氧剥夺造成的细胞损伤具有保护作用，同时也表明壮通饮的神经保护作用呈现出剂量依赖的特点。

NADPH氧化酶(NOX)在卒中的发病机制中发挥作用，尤其是NOX2在缺血性卒中的发生发展过程中扮演了重要角色[24-25]。既往有很多研究已经证实抑制NOX2活性能够预防和治疗缺血性脑损伤[26-28]。本研究发现糖氧剥夺增强了NOX2在星形胶质细胞中的表达，并证实NOX2在糖氧剥夺导致的星形胶质细胞缺血性损伤中发挥了重要作用。壮通饮能够抑制糖氧剥夺后星形胶质细胞中NOX2的表达，说明壮通饮对缺血性脑损伤具有神经保护作用，而这种保护作用正是通过抑制NOX2的活性起作用的。为进一步验证壮通饮通过抑制NOX2发挥神经保护作用，我们使用夹竹桃麻素这种NOX2抑制剂进行实验，结果显示夹竹桃麻素能够抑制糖氧剥夺后星形胶质细胞中NOX2的表达，说明壮通饮能够发挥与NOX2抑制剂相同的作用。研究证实NOX2产生的活性氧(ROS)是体内ROS的主要来源，ROS的产生加剧了缺血性脑损伤。我们的研究结果表明壮通饮通过抑制NOX2的活性发挥保护星形胶质细胞缺血性损伤的作用可能是通过抗氧化机制来实现。但还需要更深入的研究来探索壮通饮发挥神经保护作用的机制，并进一步在体内(动物)实验中验证这些结果。

综上所述，壮通饮对糖氧剥夺诱导的星形胶质细胞损伤具有保护作用，这种保护作用主要是通过抑制细胞内NOX2的活性来实现的。