银杏内酯B对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的抗氧化和抗炎作用研究

杨雨微，陈 璟，汪 洁，陈 静，吕志阳

(南京中医药大学 翰林学院，江苏 泰州 225300)

《2016年中国心血管病报告》指出：我国心血管系统疾病(Cardiovascular diseases，CVD)患者约2.9亿，每5名成人中就有1人罹患，是造成人类死亡的重要原因，随着人们的生活方式及饮食结构发生显著改变，致使CVD的发病人数呈逐年上升趋势[1]。动脉粥样硬化疾病(Aherosclerosis，AS)是严重危害人类健康的常见病，也是诱发CVD的主要病理基础，其发病机制及治愈策略尚未完全清楚，因此寻找安全有效抑制AS发生的策略对于降低CVD的发病率意义重大[2]。

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属现存唯一的植物，也称之为“自然界的活化石”[3]，具平喘敛肺、化瘀止痛等生理功能，其提取物主要成分为黄酮类和萜内酯类成分，已广泛用于治疗呼吸系统和心脑血管系统等疾病。有研究表明，银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)作为银杏内酯类成分的主要活性物质，具较好的抗AS作用[4]，本试验通过建立AS小鼠模型并灌胃给予GB，观察其对炎症因子和抗氧化作用的影响，探讨其对AS血管的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和饲料

40只8周龄ApoE-/-小鼠，购自江苏常州卡文斯动物实验有限公司(许可证号：SCXK(苏)2016-0010)，所有实验获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(许可证号：SCXK(苏)2018-0049)。高脂饲料配方：0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、2.5%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、76.8%普通饲料。

1.2 药品和试剂

GB原料药(批号：20191225，含量：97.23南京紫曦生物制品有限公司)；辛伐他汀片(鲁南贝特制药有限公司)；TFN-α试剂盒(上海酶联生物公司)；IL-1β试剂盒(上海酶联生物公司)；IL-6试剂盒(上海酶联生物公司)。过氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 仪器

TGL-18C-C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；移液器(法国Gilson 公司)；恒温磁力搅拌器(北京菁美瑞科技有限公司)；高清扫描仪(美国Sigma公司)；-80℃超低温冰箱(美国Thermo Scientific 公司)；高速微量离心机(美国Thermo Scientific 公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物模型及给药方案

40只雄性8周龄ApoE-/-小鼠，适应性饲养一周后，空白对照组小鼠(8只)喂养正常饮食，其余32只小鼠给予高脂饲料喂养。喂养5周后，将喂食高脂饲料的小鼠随机分成4组，即高脂饲料组(HFD，n=10，0.9%氯化钠灌胃)、GB低剂量组(20mg·kg-1·d-1灌胃)、GB高剂量组(40mg·kg-1·d-1灌胃)、阿托伐他汀组(1.3mg·kg-1·d-1灌胃)[5]。给药4周后，将小鼠处死，进行指标检测。

1.4.2 抗氧化指标测定

末次给药后禁食不禁水12 h，小鼠眼眶取血，血液以3000 rpm离心10 min分离血清，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4.3 炎症因子的测定

末次给药后禁食不禁水12 h， 小鼠眼眶取血，血液以3000 rpm离心10 min分离血清， 采用双抗体夹心ELISA法上酶标仪检测TNF- α、IL-1β和IL-6的表达水平，操作按试剂盒说明书进行，在10 min内测定450 nm波长下各孔的吸光度(OD值)并算出标准曲线。

2 结果

2.1 银杏内酯B对血清中SOD及MDA水平的影响

试验结果表明：与空白组相比，模型组的SOD明显降低(P<0.01)，MDA明显升高(P<0.01)，表明造模成功；与模型组相比，GB低、高剂量组的SOD均有不同程度的升高(P<0.01)，MDA也有不同程度的降低(P<0.01)，其中高剂量组作用与辛伐他丁组相当，效果显著，详见表1。

表1 不同给药组给药后对小鼠SOD、MDA的影响

2.2 银杏内酯B对血清中的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的影响

试验结果表明：与空白组相比，模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均有显著的提高(P<0.01)，具有显著性差异，表明造模成功；与模型组相比，GB不同剂量给药组的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低(P<0.01)，且GB高剂量组与辛伐他汀组效果相当，详见表2。

表2 不同给药组给药后对小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

3 讨论

AS的发生发展过程中，可产生氧化及诱导血管基因表达等加剧疾病情况，MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，MDA的测定常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，是反映氧化应激较好的指标[6]。本研究观察了不同剂量组GB给药对AS小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响，发现模型组血清SOD 活性降低，MDA 含量升高，较空白组有显著性差异。这表明高脂饮食ApoE-/-小鼠体内抗氧化防御机制损伤，GB高、低剂量组能减少血清MDA生成、增强SOD活性，提示GB可减弱脂质过氧化反应，增加氧自由基清除能力，从而能够拮抗AS时产生的氧自由基对机体的损害，并能够明显改善动脉粥样硬化小鼠的抗氧化能力[7]。

炎症反应贯穿于 AS 发生的全过程，“炎症学说” 已成为 AS 发病机制的主流学说之一[8]。单核-吞噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞会分泌多种炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α等)，这些细胞因子又可诱导平滑肌细胞的凋亡，促进AS的发生和发展。TNF-α具有抑制内皮细胞增殖、促进凋亡、诱导细胞间黏附分子表达等功能，在AS、代谢紊乱和炎症反应中发挥重要的介导作用，可诱导其他炎症因子的表达和释放。IL-1β可刺激血管内皮细胞增殖，促进中性粒细胞对血管壁的黏附，引起平滑肌细胞增生，在AS的炎症进程中，导致血管壁损伤、增厚、血栓形成。IL-6是机体对炎性刺激做出反应时分泌的多功能细胞因子，是炎性介质网络的关键成分，参与内皮细胞损伤、单核细胞内膜下迁移和促凝性质的改变，并可与其它炎性因子起调节作用。本试验表明GB干预高脂喂养的ApoE-/-小鼠， 能够显著降低其血清中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，且GB高剂量组降低的作用更佳，应具有剂量依赖性。因此，GB对ApoE-/-小鼠AS 具有一定的治疗作用，其作用环节可能与抗氧化、抑制炎症因子表达以及保护血管内皮细胞有关。