小麦与浮小麦中葡萄糖和棉子糖提取与测定方法研究

白吉庆，王鹏飞，张姣姣，张 红，王晓婷，张 晗,2，杨 琳,2，杨 蕾

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.陕西省中药原料质量监测技术服务中心，陕西 咸阳 712046；3.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710000)

小麦为禾本科植物小麦(TriticumaestivumL.)的干燥成熟果实[1]，浮小麦为其干燥轻浮瘪瘦的果实[2]，其性凉，味甘咸，入心、脾、肾经，具有止汗、除热、益气的功效，对自汗、盗汗、骨蒸劳热等疾病有较好的疗效[3-5]。葡萄糖是生命活动中不可缺少的物质，在新陈代谢过程中起着重要的作用[6]。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，主治体虚多汗，可以调节肠道内细菌平衡，显著改善肠道菌群，保护肝脏，增加机体免疫力，抗肿瘤，促进钙的吸收等[4,7-10]。2015年版《中国药典》未对小麦、浮小麦的质量控制做具体要求，仅在四部中记载了小麦、浮小麦的来源。本试验通过柱前衍生化[11-16]，采用高效液相色谱建立小麦、浮小麦中葡萄糖和棉子糖的含量测定方法，为小麦、浮小麦的质量控制和质量评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

戴安 Ultimate 3000 全自动高效液相色谱仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司，包含 Ultimate 3000 四元梯度泵、Ultimate 3000 自动进样器、Ultimate 3000 二极管阵列检测器、Chromeleon 6.8色谱工作站)；Discovery DV215CD 型双量程电子分析天平(瑞士赛多利斯集团，0.01 mg，0.1 mg)；Direct-Q 3UV 纯化水机(默克密理博)；超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DFT-50A 手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司制造)；HX-25 型电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；德国Christ ALPHA 1-2LD plus 冷冻干燥机(上海甄明科学仪器有限公司)；TGL-16G 型台式离心机；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，安捷伦科技有限公司)。

1.2 试剂与药材

水为超纯水(自制)；乙腈、甲醇(色谱纯)购自美国迪马公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(纯度 ≥ 99.0%)购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；葡萄糖对照品(HPLC ≥ 98%，批号：BCY-000577)购自江西佰草源生物科技有限公司；棉子糖对照品(HPLC ≥ 98%，批号：BCY-01104)购自上海源叶生物科技有限公司；小麦、浮小麦药材信息见表1。

表1 小麦、浮小麦样品来源信息

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺优化

以葡糖糖、棉子糖含量为指标综合评分，按L9(34)正交试验表安排试验，对试验结果进行方差分析，考察乙醇浓度(A)、超声时间(B)和提取次数(C)三个因素的最佳提取工艺。每个因素三个水平，见表2。

表2 葡萄糖、棉子糖提取工艺因素水平表

1.3.2 葡糖糖、棉子糖含量测定

1.3.2.1 色谱条件 Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为 0.01 mol/L pH 值为7的乙酸铵缓冲液：乙腈(V/V，80∶20)；体积流量1 mL/min；检测波长254 nm；柱温30℃；进样量5 μL。

1.3.2.2 PMP溶液的制备 精密称取435 mg PMP，置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得；氢氧化钠溶液的制备：精密称取60 mg氢氧化钠，置5 mL的量瓶中，加水溶解至刻度，即得。

1.3.2.3 对照品衍生溶液的制备 精密称定葡萄糖对照品 5.85 mg，棉子糖对照品 6.61 mg，加PMP溶液和氢氧化钠溶液各1 mL，置70℃水浴锅中反应1.5 h，用盐酸调pH约7，加入1 mL二氯甲烷混匀，离心(13 000 r/min，5 min)，取上清液，用冰醋酸调pH 4～5，加入1 mL二氯甲烷混匀，至二氯甲烷萃取层近无色，取上清液于60℃水浴挥干，用1 mL水溶解，过C18小柱，先用3 mL水洗脱，弃去洗脱液，再用3 mL 25%乙腈洗脱，收集洗脱液，60℃水浴挥干，残渣精密加入1 mL水充分溶解，过 0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为对照品衍生化溶液的储备液。取上述储备液适量加水稀释成一系列浓度梯度的对照品衍生化溶液(葡萄糖衍生物质量浓度分别为0.139 5、0.279、0.697 5、1.395、2.79 mg/mL，棉子糖衍生物质量浓度分别为0.165 25、0.826 25、3.305、9.915、16.525、26.44 mg/mL)。

1.3.2.4 供试品衍生溶液的制备 取小麦、浮小麦粉末各3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，称定重量，超声处理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，过滤，滤液于80℃水浴蒸干，残渣加水溶解，冷冻干燥。取冻干后样品6 mg，精密称定，按“1.3.2.3”项下的方法“自加PMP溶液和氢氧化钠溶液各1 mL起”，进行衍生化处理，即得供试品衍生化溶液。

1.3.2.5 线性关系 精密吸取“1.3.2.3”项下的溶液各1 μL注入液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标 (Y)，质量浓度(mg/mL)为横坐标 (X)，进行线性回归。

1.3.2.6 精密度试验 精密吸取“1.3.2.4”项下的同一供试品溶液1 μL，连续进样6次， 按“1.3.2.1”项下色谱条件进行测定。

1.3.2.7 重复性试验 精密称取同一批号供试品6份, 按“1.3.2.4”项下方法制备供试品衍生化溶液, 按“1.3.2.1”项下色谱条件进行测定。

1.3.2.8 稳定性试验 精密吸取“1.3.2.4”项下的同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、16 h精密吸取1 μL，按“1.3.2.1”项下色谱条件测定。

1.3.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的浮小麦、小麦粉末各6份，分别精密加入一定量的葡萄糖、棉子糖对照品，按“1.3.2.4”项下方法制备供试品衍生化溶液，按“1.3.2.1”项色谱条件下进样测定。

1.3.2.10 样品的含量测定 精密吸取“1.3.2.4”项下的供试品衍生化溶液各5 μL，按“1.3.2.1”项色谱条件下进样测定。

2 结果

2.1 葡萄糖、棉子糖提取工艺优化

由表4、5可见，影响葡萄糖、棉子糖提取的因素主次顺序为乙醇浓度>超声时间>提取次数，其中乙醇浓度对葡萄糖、棉子糖提取的影响有统计学意义；超声时间和提取次数对提取工艺无统计学意义，但由表3可知，提取30 min比提取15 min和45 min的含量高，提取次数对含量影响不大。综合考虑，既要葡萄糖、棉子糖提取含量最高，又要节约成本，所以确定最佳提取工艺为A2B2C1，即用60%乙醇超声30 min提取1次。

表3 优化葡萄糖、棉子糖提取工艺的正交试验结果

表4 葡萄糖含量方差分析结果

表5 棉子糖含量方差分析结果

2.2 色谱条件的优化

采用二极管阵列检测器对含量测定的检测波长进行了选择。结果表明，检测波长在254 nm处，所得各色谱峰谱图信息量较大，且色谱峰分离度较好，所以选用254 nm。对流动相的比例进行了优化，最终选用“1.3.2.1”项下的色谱条件进行等度洗脱。

2.3 葡萄糖、棉子糖含量测定

所得回归方程为：y葡萄糖=4.416 7x-0.086 2，R2=0.999 5，葡萄糖在0.139 5～2.79 mg/mL范围内呈现良好的线性关系；y棉子糖=6.613 5x-0.690 3，R2=0.999 9，棉子糖在0.165～26.44 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。精密度试验中葡萄糖、棉子糖峰面积的RSD值分别为2.74%、1.46%，表明仪器精密度良好；稳定性试验中葡萄糖、棉子糖峰面积的RSD值分别为2.31%、2.09%，表明16 h内供试品的稳定性良好；重复性试验中葡萄糖、棉子糖峰面积的RSD值分别为1.51%、1.76%，表明该方法的重复性良好；葡萄糖、棉子糖的平均回收率分别为98.7%(RSD=2.42%)、99.1%(RSD=2.81%)，表明该方法的回收率良好(表6)。小麦和浮小麦中葡萄糖、棉子糖含量见表7，对照品和供试品色谱图见图1。

表6 加样回收率试验结果(n=6)

表7 小麦、浮小麦中葡萄糖与棉子糖的含量

图1 对照品与供试品HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms of chemical reference substances and sample.注：A-棉子糖对照品；B-葡萄糖对照品；C-小麦供试品；D-浮小麦供试品

3 讨论

本试验分别考察了提取溶剂(30%乙醇、60%乙醇、 90%乙醇)，超声时间(15、30、60 min)和提取次数，结果60%乙醇超声30 min 提取1次的样品溶液的峰形好，峰面积较大，而且分离度较好。考察了反应的水浴温度和时间，表明在70℃水浴锅中反应1.5 h，反应完全，故反应温度和时间确定为70℃水浴中反应1.5 h。

本试验分别考察了流动相乙腈-0.01 mol/L乙酸铵缓冲液、乙腈-0.03 mol/L乙酸铵缓冲液、乙腈-0.05 mol/L乙酸铵缓冲液，结果发现采用乙腈-0.01 mol/L乙酸铵缓冲液为流动相，各色谱峰分离效果最好。考察了检测波长245、254、265 nm，柱温25、30、35℃，结果表明在254 nm和30℃下，色谱峰峰形好，吸收强度高。

含量测定结果表明：小麦中葡萄糖含量最高的是凤翔县崖弯村11.75 mg/mL，最低是凤翔县关家村6.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是凤翔县白家凹村101.79 mg/mL，最低是凤翔县关家村55.28 mg/mL；浮小麦中葡萄糖含量最高的是凤翔县贷箭门前12.95 mg/mL，最低是凤翔县宋家村7.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是凤翔县白家凹村137.05 mg/mL，最低是凤翔县关家村95.98 mg/mL。造成凤翔县各地葡萄糖和棉子糖含量差异的原因有待进一步研究。小麦和浮小麦中棉子糖含量远远大于葡萄糖含量。

本试验建立了不同产地小麦、浮小麦中葡萄糖和棉子糖的柱前衍生HPLC含量测定方法。方法学结果表明其精密度、重复性、稳定性良好，可为小麦、浮小麦质量标准的制定提供试验依据。