不同剂量脱氧雪腐镰刀菌烯醇对蛋鸡肝脏组织形态学的影响

尚月丽，陈菊红，杨俊花，赵志辉

(1.上海农林职业技术学院，上海 201699；2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)属单端孢霉烯族化合物，是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌和雪腐镰刀菌等产生次级代谢产物，是世界上分布最广泛的真菌毒素之一。DON可以通过污染的小麦、燕麦和玉米等原料进入食品和饲料中[1-2]。DON性质稳定，耐热、耐压、耐弱酸、耐储藏，一般的加工过程都不会破坏其结构，降低毒性。因此，DON极易通过食物链对动物产生急性、慢性、细胞、免疫等多种毒性作用，危害动物健康，给养殖业造成巨大经济损失。

近年来，不同的研究指出DON可引起肝脏、胸腺、脾脏、肾脏、肠道和脑组织的损伤，其中肝脏是主要的靶器官。Kubena等(1987)报道从1日龄到产蛋期，蛋鸡饲料中DON含量为18 mg/kg，从开始产蛋持续观察6个周期，每个周期28 d，未发现肝脏组织有明显的病理学变化。日粮中添加DON(1和5 mg/kg饲料含量)不影响肉鸡肝脏的重量[3]。肉鸡分别饲喂3.4、8.2和10 mg/kg 饲料的DON含量不影响肝脏的脂质过氧化酶[4-5]。然而，Moon等[6]在鸡胚内注射2g/g蛋重的DON，24 h后检测发现鸡胚肝脏内出现脂肪化空泡，48 h后肝脏空泡化坏死进一步增加；出生后进行二次口服DON暴露，发现48 h后脂滴积聚显著增加。Tiemann等[7-8]报道，分别对发情期母猪和妊娠期的母猪饲喂含DON和玉米赤霉烯酮的饲料，能引起肝细胞的空泡化坏死。饲喂黄曲霉毒素和DON联合污染的饲料则会增加肝组织的纤维化[9]。然而，Pollmann等(1985)发现DON不会对猪肝脏产生显著影响。小鼠上的研究表明，每千克体重25 μg DON能够引起小鼠肝脏小叶间静脉周围组织坏死，中央静脉周围单核细胞浸润[10]。但也有报道显示，71～355 μg/kg DON饲喂小鼠，不会引起肝脏重量的改变[11]。此外，不同动物对DON的敏感程度存在一定的差异，其中猪最为敏感，家禽与啮齿类、犬和猫相比敏感性较差，但是家禽比反刍动物敏感，这可能与反刍动物瘤胃内的微生物代谢DON有关[12-13]。以上研究发现，即使比较敏感的动物，报道结果也不一致，在禽上报道的结果也不一致，DON能否对蛋鸡肝脏组织产生损伤有待进一步研究。

本课题组前期研究发现，蛋鸡产蛋期间灌服DON，1 mg/kg组血清肝脏碱性磷酸酶(ALP)活性显著增加；当DON灌服剂量达10 mg/kg时产蛋量明显下降，显著降低血清中ALP活性、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性[14]。然而，DON对蛋鸡肝脏功能的影响是否伴随肝脏组织病理学的改变，有待进一步研究。

本研究旨在观察不同剂量DON对蛋鸡肝脏指数及组织形态学的影响，为探索DON对肝脏损伤的影响提供组织病理学数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DON标准品，纯度≥99%(新加坡公司Pribolab)，购自北京普华仁生物技术开发有限公司。使用前用无菌生理盐水稀释。

1.2 试验设计与饲养管理

随机选择体况良好，体重(1.90 ± 0.2)kg和产蛋率基本一致的26周龄海兰蛋鸡120只，随机分为6个组，每组4个重复，每个重复5只鸡，预饲期1周。所有鸡采用灌胃方式，对照组灌胃 0.2 ml 等量的生理盐水，其他各试验组，分别按体重灌胃1、5、10、20、50 mg/kg DON。试验期间每天灌服1次，连续灌服6周。试验鸡按封闭式蛋鸡养殖场规定进行饲养管理，采用2层阶梯式笼养，每天保证充足光照16 h，室温16～20 ℃，湿度50%～60%，蛋鸡自由采食、饮水，每日7:00投喂1次。蛋鸡饲喂基础日粮参考文献[14]。

1.3 样品采集及检测

试验结束，每组每个重复随机选取2只鸡，称重，脱颈致死，后打开腹腔，将肝脏分离出，并称重，计算肝脏指数。肝脏指数(%)= 肝脏重量(g)/体重(g)100%。

在不同处理组肝脏同一部位采集样品，迅速置于10%福尔马林溶液中固定24 h。常规脱水、透明、透蜡和包埋，制作石蜡切片，切片厚5 μm，采用HE常规方法进行染色。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 DON对蛋鸡肝脏指数的影响

表1显示，当摄入DON达到10 mg/kg时，肝脏指数较对照组极显著增加(P<0.01)。当摄入DON量升高到20 mg/kg时，肝脏指数开始减少，但是与对照组和其他剂量组(1、5、50 mg/kg)比较并没有显著差异(P>0.05)。当摄入的剂量增加到50 mg/kg时，肝脏指数与对照组和其他剂量组(1、5、10 mg/kg)相比均显著下降(P<0.05)。

表1 不同剂量DON对蛋鸡肝脏指数的影响 %

2.2 DON对肝脏结构的影响

对照组(图1A)中肝索排列整齐规律，中央静脉结构完整。1 mg/kg DON组(图1B)，小叶间静脉周围有炎症细胞浸润，在炎症细胞与肝组织交界处，肝细胞空泡化严重。5 mg/kg DON组(图1C)，中央静脉管腔扩大，周围出现了炎症细胞浸润坏死灶。10 mg/kg DON组(图1D)，汇管区出现了大量的炎症细胞，血管扩张，内充盈大量红细胞，血管壁结构不清楚。20 mg/kg DON组(图1E)，肝血窦腔增大内出现淤血，在汇管区可见小叶间胆管，在小叶间静脉周围出现局灶性溶解性坏死。50 mg/kg组(图1F)，汇管周围肝实质现大量的局灶性溶解性坏死，并有空洞现象出现，坏死区外周发生纤维化。

A.对照组；B.1 mg/kg组，粗箭头显示肝小叶间静脉中充满血液，细箭头显示肝小叶1区肝细胞空泡化变性；C.5 mg/kg组，粗箭头显示中央静脉静脉管腔增大，细箭头显示中央静脉周围形成炎症坏死灶；D.10 mg/kg组，细箭头显示大量炎症细胞浸润，粗箭头显示小叶间静脉血管充血；E.20 mg/kg组，细箭头显示肝血窦淤血，窦腔增大，粗箭头显示局灶性溶解性坏死；F.50 mg/kg组，细箭头显示局灶性溶解性坏死区，粗箭头显示溶解空洞，三角形显示纤维化

3 讨论

DON作为谷物中检出率和检出量最高的霉菌毒素，对人类和动物的健康均构成了严重威胁[15]。肝脏是主要的功能器官，可进行胆红素、胆汁酸、碳水化合物、脂质以及药物、杀虫剂和致癌物质等有毒副作用物质的代谢，也是蛋白的合成和执行免疫功能的主要器官[16]。Prelusky等(1986)给白来航鸡灌胃放射标记的DON，小于1%剂量在肠道内被吸收，不过在肾脏、肝脏、脾脏组织分布最高，表明肝脏是DON毒性作用的靶器官。本试验发现1和5 mg/kg DON不影响肝脏指数，这一发现与Wickramasuriya等[17]饲喂0、0.25、0.5、0.75和1.0 mg/kg DON污染的饲料没有对蛋鸡肝脏指数产生影响的结果一致，与Awad等[3]研究肉鸡饲料中1或5 mg/kg DON不影响肝脏指数的报道类似。同样，Morrissey等(1985)给大鼠饲喂含20 mg/kg DON的饲料也没有发现对肝脏指数产生影响。与Lee等[18]报道饲料中等含量的黄曲霉毒素(1.5 mg/kg)与DON(1.5 mg/kg)混合和高剂量的黄曲霉毒素(2.0 mg/kg)与DON(2.0 mg/kg)均能够增加产蛋鸡肝脏重量类似。本试验发现10 mg/kg DON引起产蛋鸡肝脏指数增加，与Bergsjo等(1993)报道猪饲料中3.5 mg/kg DON引起猪肝重增加的结果一致。随着产蛋鸡摄入DON的剂量进一步增加到50 mg/kg，产蛋鸡肝脏指数较对照组显著降低，与肉鸡饲料中5 mg/kg 的DON降低肝脏重量结果一致[19]，与火鸡上自然污染3种真菌毒素(含DON)检测到火鸡肝脏重降低[20]的研究报道也类似。猪饲料中含6 mg/kg DON也同样检测到肝脏重量降低[21]。给猪饲喂天然污染DON的饲料，也能够检测到肝脏重量降低[22]。Forsell等(1986)报道小鼠饲料中DON含量为10和20 mg/kg也同样能够检测到小鼠肝脏重量降低。以上不同物种得到了类似的结果，低剂量可能不影响肝脏重量，中剂量可能引起肝脏重量升高，高剂量或者更高剂量可以引起肝脏重量降低。本试验显示，随着每日摄入DON的剂量增加，肝脏指数升高，随着DON摄入量的进一步升高，肝脏指数又开始下降，显示DON对肝脏指数的影响呈剂量依赖性。自然污染饲料中是真菌毒素的混合物，与单一毒素引起肝脏变化可能存在剂量上的不一致。

肝脏作为重要的功能器官，是不同外源性有毒有害物质的重要靶组织，也是毒性评价的重要指标。正常的肝脏形态学：肝小叶呈六边形是肝脏结构和功能的最小单位，肝小叶的中间形成中央静脉，肝小叶六边形角处形成汇管区，由门静脉、胆管、肝动脉、神经、淋巴管组成，垂直汇管区肝门静脉分出小叶间静脉，进入肝小叶内[23]。不连续的肝细胞构成汇管区的外部界限，被称为限制板。血液从汇管区分出小叶静脉和小叶动脉进入小叶内，经过肝血窦最后汇入中央静脉，紧邻汇管区小叶间动脉和小叶间静脉分枝处的肝小叶为1区，中央静脉周围的肝实质为3区，位于1区和3区中间的为肝小叶2区，1区肝细胞氧气和营养物质丰富，2区、3区次之[16,23]。区域结构的识别在肝脏组织病理和毒理学评价中起到很重要的作用[24]。

本研究中，1 mg/kg的DON靠近小叶间静脉1区可观察到肝细胞空泡化变性，与给婆罗门鸡饲喂含DON等多种真菌毒素混合污染的饲料引起鸡肝脏细胞发生空泡化变性相类似[25]；同样给猪饲喂含DON的饲料，也发现肝细胞胞质发生空泡化变性[26-27]。在本试验中，小叶间静脉周围有炎症细胞浸润，与小鼠每日灌胃2.5和25 μg/kg 的DON出现汇管区单核细胞浸润的报道结果一致[10]。通常，肝脏细胞的空泡性变性是由胞浆内的脂滴沉积形成[7]。Hamilton等(1985)报道给白来航蛋鸡饲喂DON污染的饲料，鸡肝脏总脂和甘油三酯含量升高，为组织学观察到脂滴的形成提供了重要依据。

该试验的前期研究发现，1.0 mg/kg能引起血液中ALP升高[14]。目前组织学观察发现，小叶间静脉周围炎症细胞浸润和1区肝细胞的空泡化，从组织形态上印证了DON对肝细胞的损伤，可能是受损的肝细胞释放出ALP，引起血液中ALP升高。

此外，当DON剂量达到10 mg/kg时，汇管区出现大量炎症细胞浸润，血管扩张膨胀，同时检测到肝脏指数升高。当DON剂量增加20 mg/kg，汇管周围可看到局灶性溶解性坏死，此时肝脏指数较10 mg/kg组降低，但与对照组没有差异。随着剂量进一步高到50 mg/kg，汇管区周围(肝小叶1区)呈现大量局灶性溶解性坏死，可见溶解空洞，同时伴随肝脏指数下降。Tiemann等[7-8]电镜检查发现饲料中DON能够引起发情母猪和妊娠母猪的肝细胞内积聚大量的自噬体，也许大量自噬体的出现导致大量肝细胞死亡，被炎症细胞所吞噬，形成局灶性溶解性空洞。本研究发现DON剂量依赖性引起肝脏的渐进性损伤，观察到局灶性溶解性坏死后肝脏形成空洞，具体的作用机制有待进一步深入研究。

综上，通过给产蛋期蛋鸡每日口服不同剂量的DON发现，1、5、10、20、50 mg/kg的DON均对肝脏产生不同程度的病理性影响，并且随着剂量的增加，肝脏病理性变化呈现渐进式损伤增加。10 mg/kg DON增加肝脏指数，伴随小叶间静脉充血，汇管区大量炎症细胞浸润；当DON增加到50 mg/kg时，肝脏指数降低，肝脏内出现大量的局灶性溶解性坏死和空洞。研究表明，产蛋鸡日粮中DON以剂量依赖性对肝脏产生渐进性肝组织损伤。