日粮纤维水平对二花脸猪大肠肠道细胞增殖与凋亡基因表达和黏膜菌群数量的影响

付金剑，李梦玥，胡音，王欢,2，周五朵,2，李平华,2，吴承武,2，杜陶然,2，蒲广,2，黄瑞华,2*

(1.南京农业大学养猪研究所,江苏 南京 210095；2.南京农业大学淮安研究院,江苏 淮安 223001)

随着国家“绿色”发展理念的提出和饲用抗生素逐渐被禁用，猪健康尤其是仔猪的肠道健康面临着很大挑战，高热量、高蛋白的饲料配方不能满足目前的需要[1]。日粮纤维(diary fiber，DF)能够影响肠道环境，为肠道健康提供有利条件，但不同的饲料中DF有很大的差异，对肠道的影响也不相同[2]。我国小麦产量居世界前列，其加工成面粉的过程中产生了大量副产品麸皮有待开发利用。麸皮中含有丰富的DF，这些DF不能被小肠的内源性水解酶水解，但可以在大肠中微生物的作用下被分解[3]。微生物发酵产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)能够被宿主肠道细胞作为能源吸收，并改善肠道菌群，肠道菌群的变化与猪健康密切相关[4-5]。已有大量研究表明，DF能够显著影响肠道微生物的组成和功能，提高抵抗病原菌肠道感染的能力，并促进肠道上皮细胞的增殖，提高机体免疫力[6-7]。肠道黏膜是阻止各种病原微生物与毒素从肠道进入机体的重要屏障结构，肠道黏膜细胞增殖与凋亡变化会影响猪的机体健康。因此，研究麸皮的潜在利用价值，不仅能减少饲料成本，还能提高猪的健康水平，减少抗生素的使用，具有重要的实际意义。

二花脸猪是我国的地方猪种，与国外引进的瘦肉型猪种相比，除了具有产仔率高、母性好、肉质鲜美等优良的种质遗传特性，还具有较强的高纤维日粮耐受能力[8]。但有关不同纤维水平对其大肠肠道细胞增殖与凋亡基因的表达和肠道微生物的影响未知。

本试验旨在研究日粮麸皮替代水平对二花脸猪大肠肠道细胞增殖与凋亡基因表达和微生物的影响，为合理应用麸皮等高日粮纤维饲料原料，降低养殖成本，提高猪健康水平提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择体重(38.25±0.89)kg二花脸育肥阉公猪20头作为试验动物，购于常州市焦溪二花脸猪专业合作社。

1.2 试验设计与饲养管理

饲养过程在南京农业大学淮安研究院试验猪场完成，将试验猪随机分成4个处理组，利用自动饲喂系统饲喂，可以准确提供每头猪的日采食量与个体体重，因此每头猪认定为1个重复，每组5个重复，试验期间自由采食和饮水。整个过程预饲期10 d，正试期28 d。预饲期所有猪饲喂相同基础日粮，正试期开始后设4个纤维水平处理组，分别饲喂基础日粮、7%麸皮替代基础日粮、14%麸皮替代基础日粮和21%麸皮替代基础日粮。所有试验猪饲养在同一个猪舍内，每个栏大小为5.25 m×2.50 m，猪圈由半漏粪的地板、空气源热泵、奥斯本自动饲喂站和节水型饮水碗组成，猪舍内的环境温度通过空气源热泵保持稳定。

1.3 试验日粮

基础日粮配制参考中国《猪饲养标准(NY/T 65—2004)》肉脂型生长肥育猪标准制定，饲料委托安佑生物科技集团股份有限公司进行订制生产。日粮配方及营养水平具体信息见表1。

表1 日粮配方及营养水平

1.4 样品采集

所有试验猪按照规范流程运送至淮安苏食肉品有限公司现代化屠宰场经检疫进行屠宰分割。所有猪只按照应激最小化原则电击致晕、放血后，流水线上打开腹腔，取出完整胃肠道，分离出大肠。分别在盲肠和结肠中部截取约4 cm肠段，用生理盐水浸泡去除内容物，用无菌载玻片刮取肠道黏膜，装至2 mL高压灭菌过的冻存管中，迅速放入液氮中保存，实验室-80 ℃保存。其中结肠黏膜用于肠道细胞增殖、凋亡基因表达的定量分析，盲肠黏膜用于肠道微生物分析。

1.5 指标测定

1.5.1 结肠细胞增殖、凋亡基因表达量测定

TRIzol法提取黏膜RNA，用分光光度计测定RNA浓度和纯度，符合质量要求的RNA利用反转录试剂盒(Vazyme，南京)反转录为cDNA。利用实时荧光定量PCR仪器进行定量分析，使用20 μL体系(Vazyme，南京)，体系内各成分如下：EvaGreen 2× qPCR MasterMix 10 μL，上下引物各0.6 μL，双蒸水6.8 μL，DNA模板2 μL，每个样品重复3次。其中引物序列信息见表2。

表2 结肠细胞凋亡与增殖基因引物序列信息

1.5.2 盲肠黏膜菌群16S rRNA基因拷贝数测定

使用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取微生物总DNA，由南京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列信息见表3。通过PCR扩增和1.2%琼脂凝胶电泳进行各引物的验证，PCR 扩增反应体系反应条件如下：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上下引物各1 μL，双蒸水1 μL。验证后的引物进行PCR扩增，纯化回收 PCR 产物，制备重组质粒细菌并做同源性分析。克隆成功后提取重组质粒DNA并进行梯度稀释用于标准曲线的建立，利用荧光定量PCR仪对样品中相关细菌16S rRNA拷贝数进行定量分析。实时荧光定量PCR体系为：TB Green PremixExTaqⅡ 10 μL，上下引物各0.8 μL，双蒸水6.4 μL，DNA模板2 μL。

表3 盲肠黏膜菌群实时荧光定量PCR引物

1.6 数据统计与分析

用Excel对试验数据进行初步处理后，微生物16S rRNA基因拷贝数取以10为底的对数后参与统计分析，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析。若P<0.05则表示其差异显著，若0.05

2 结果与分析

2.1 日粮纤维水平对二花脸猪结肠细胞增殖与凋亡基因表达量的影响

由表4可见，在第28天，与对照组相比，14%日粮麸皮替代水平显著提高了二花脸猪结肠Bcl-2L1基因表达量(P<0.05)。日粮麸皮替代水平对二花脸猪结肠Bax和Capase3基因表达量无显著影响(P>0.05)。

表4 日粮纤维水平对二花脸猪结肠细胞增殖与凋亡基因表达量的影响(n=5)

2.2 日粮纤维水平对二花脸猪盲肠黏膜菌群16S rRNA基因拷贝数的影响

由表5可见，在第28天，日粮麸皮替代水平对二花脸猪盲肠总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌16S rRNA基因拷贝数无显著影响(P>0.05)。

表5 日粮纤维水平对二花脸猪盲肠黏膜菌群16S rRNA基因拷贝数的影响

3 讨论

3.1 日粮纤维水平对二花脸猪结肠细胞增殖与凋亡基因表达量的影响

肠道黏膜是阻止各种病原微生物与毒素从肠道进入机体的重要屏障结构，肠黏膜屏障由物理、免疫、化学与生物屏障构成，其中物理屏障是最基础的防御结构，由排列紧密的黏膜上皮细胞组成，肠黏膜上皮细胞主要发挥的是分泌与吸收营养物质的功能[15-16]。健康的机体肠道上皮细胞维持着增殖与凋亡的动态平衡状态，如果凋亡基因表达失调，使大量黏膜细胞程序性死亡，将会导致机体肠道出现病理变化[17]。Caspase3被认为是最重要的凋亡执行体，其激活是不可逆凋亡的标志。Bcl-2蛋白家族在调控细胞凋亡中起着重要作用，Bcl-2L1是一个抗凋亡基因，Bax是一个促凋亡基因，两者在细胞凋亡过程中起着重要作用。李超等[18]研究表明，Bcl-2L1的表达增多表示细胞的抗凋亡基因在大量表达，Bax与Caspase3的表达增多是凋亡增加的表现。

Jin等[19]研究发现提高日粮纤维水平对猪肠道上皮细胞增殖有促进作用。本试验对结肠细胞增殖与凋亡基因(Bcl-2L1、Bax、Caspase3)的表达量进行了测定，在14%麸皮替代水平时，发现抗凋亡基因(Bcl-2L1)的表达量显著上升，而促进细胞凋亡的基因(Bax、Caspase3)表达量对纤维日粮的替代没有响应。此结果说明14%麸皮替代水平抑制肠道细胞凋亡，与Jin等[19]结果相同。但也有一些研究结果与本试验结果不同。Macrae等[20]研究发现提高日粮纤维含量对肠道上皮细胞的增殖并无影响。这可能是由于纤维的来源与粒度的差异造成的。

3.2 日粮纤维水平对二花脸猪盲肠黏膜菌群16S rRNA基因拷贝数的影响

前人的研究表明日粮纤维有促进有益菌生长的作用，还对有害菌的生长有抑制作用[21]。肠道中的微生物可将日粮中的纤维分解发酵，最终生成一些SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸等。这些SCFA不仅可以通过降低pH来达到减少外来菌种的定值与生长，还有研究表明乙酸在双歧杆菌抑制病原微生物定值中发挥作用，丁酸可抑制大肠杆菌的生长[22]。张永婧等[23]研究发现小麦麸皮组中猪回肠末端食靡乳酸杆菌16S rRNA基因拷贝数增加。Gerritsen等[24]发现日粮中添加麸皮与燕麦壳可降低仔猪回肠与结肠中大肠杆菌的16S rRNA基因拷贝数。Jiao等[25]发现在仔猪日粮中添加纤维寡糖可调节双歧杆菌与乳酸杆菌的16S rRNA基因拷贝数，并能降低致病菌如大肠杆菌、猪链球菌的16S rRNA基因拷贝数。

本试验结果表明日粮麸皮替代水平对结肠双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌16S rRNA基因拷贝数无影响，与Yan等[26]研究结果一致，表明日粮纤维的增加并未破坏二花脸猪的肠道微生物环境，二花脸猪肠道微生物能够耐受高纤维日粮。与其他一些研究结果不同的原因可能是试验动物日龄的不同，日粮纤维的理化性质、肠道部位、摄入时间的不同，有待进一步研究。此外，由于本研究仅开展了双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌几种微生物的定量检测，未来还有待继续开展其他种类微生物的研究，尤其是利用组学技术进行深入研究。