大黄素对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的干预作用▲

龙丹丹 张 清 占 凯 薛 娟 罗 磊

(1 湖北省宜昌市第二人民医院消化内科， 宜昌市 443000，电子邮箱：7207631@qq.com；2 广州中医药大学 第二临床医学院，广东省广州市 510000；3 湖北省中西医结合医院消化内科，武汉市 430000)

流行病学研究表明，发达国家中大约45%的死亡是由纤维化疾病引起的[1]。肝纤维化是肝脏的慢性损伤过程，是多种肝脏疾病发生发展的基础，其特征包括肝星状细胞的活化、细胞外基质的过度累积和肝脏结构的破坏[2]，如不加以控制，可进一步进展为肝硬化甚至肝癌[3]。近年来，虽然很多重要的研究结果使得人们对肝纤维化有了更深入、更全面的理解，但是目前尚无药物被证实对肝脏有明确的抗纤维化作用。目前认为肝纤维化甚至早期肝硬化是可以逆转的[4]，因此寻找和研究有效且耐受良好的抗肝纤维化药物，具有十分重要的意义。近年来，中药在抗肝纤维化方面展现出独特的优势和广阔的应用前景。大黄素是中草药的一种化学成分，主要提取自大黄、虎杖、何首乌、芦荟等中药。研究表明，大黄素具有多种药理作用，包括抗炎、抗肿瘤、抗过敏、泻下等[5-8]。还有研究显示，大黄素具有抗纤维化作用，包括抗胰腺纤维化、心肌纤维化、肺纤维化等[9-11]。目前有关大黄素抗肝纤维化的研究报道较为罕见，因此本研究通过采用四氯化碳诱导肝纤维化大鼠模型，旨在观察大黄素对肝纤维化的治疗作用，并对其作用机制做初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只健康成年雄性SD大鼠购买于湖北省疾病预防控制中心[动物合格证号：SCXK(鄂)2016-0009]，8周龄，体重180～220 g，于恒温(22℃～25℃)、湿度45%～50%的环境中适应性饲养1周。

1.2 实验试剂及仪器 四氯化碳购买于Sigma公司(产品批号：48604)；大黄素(纯度>95%)购买于上海阿拉丁生物化学试剂有限公司(产品批号：E7881)；橄榄油采用食用橄榄油；血清透明质酸、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ,PCⅢ)、Ⅳ型胶原酶联免疫分析试剂盒购买于上海西塘科技有限公司(产品批号分别为：F5737、YK127、F5712、F5734)；结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、TRIzol Reagent试剂购买于TaKaRa公司(产品批号分别为：RR047A、RR047Q、9108)；AU5821型全自动生化分析仪购自Beckman Coulter公司，LightCycler96 PCR仪购自罗氏公司。

1.3 分组及造模方法 50只大鼠适应性喂养1周后，采用完全随机分组法将大鼠分为正常组、模型组、大黄素低剂量组(15 mg/kg)、大黄素中剂量组(30 mg/kg)、大黄素高剂量组(60 mg/kg)，每组10只。正常组不予处理，大黄素各剂量组及模型组采用40%四氯化碳-橄榄油混合液(四氯化碳与橄榄油的混合比例为2 ∶3)腹腔注射给药，首剂为4 mL/kg，以后按2 mL/kg注射，2次/周，共持续8周。

1.4 干预方法 从造模第5周开始，大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组分别给予15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的大黄素灌胃，灌胃前将大黄素粉末加入生理盐水在摇床上摇匀使其充分溶解，参考文献[12]制定大黄素给药剂量。模型组及正常组给予相应剂量(1 mL/100 g)的生理盐水灌胃(四氯化碳-橄榄油混合液腹腔注射后半小时进行)。各组灌胃均1次/d，共持续4周。

1.5 标本收集 第8周末次灌胃给药后，各组大鼠禁食禁水24 h，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，无菌条件下收集大鼠门静脉血液，离心(37℃，3 000 r/min，10 min)收集血清于-20℃保存备用。同时取新鲜肝脏组织，一部分于-80℃保存，一部分采用10%多聚甲醛固定后于24 h内行石蜡包埋。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 肝功能指标检测：采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、白蛋白水平。

1.6.2 肝纤维化指标检测：采用酶联免疫吸附法测定血清透明质酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6.3 实时荧光定量PCR 法测定肝组织中CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表达水平： 取100 mg大鼠肝脏组织，按照试剂盒说明书中的步骤采用TRIzol法提取总RNA后，检测其浓度及纯度，A260/A280在1.8～2.0，表明RNA纯度较好，可用于后续实验。按照试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。取上述反转录产物1 μL作为荧光定量PCR模板，配成10 μL的PCR反应体系，包括SYBR green 5 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.2 μL，前引物0.2 μL，后引物0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。PCR反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，共反应40个循环。反应结束后，由电脑软件分析读取Ct值，以GAPDH作为内参照，使用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA 相对表达量。CTGF 上游引物为5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′,下游引物为5′-CAGTGCACTTGCCTGGATGG-3′;TIMP-1 上游引物为5′-AGCCCTGCTCAGCAAAAGG-3′,下游引物为5′-CTGTCCACAAGCAATGACTGTCA-3′；MMP-9上游引物为5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTAT-3′,下游引物为5′-CTGCTTGCCCAGGAAGACGAA-3′；GAPDH上游引物为ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.6.4 肝组织病理学变化： 将10%多聚甲醛固定的肝组织标本，经过常规脱水、石蜡包埋、切片，分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin， HE)染色和Masson染色，光镜下观察肝组织一般病理学变化及肝组织胶原纤维增生情况。

1.7 统计学分析 采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组大鼠肝脏组织病理学变化 HE染色结果显示，正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞形态正常，排列规则，无炎性细胞浸润及胶原纤维沉积;模型组大鼠肝小叶结构破坏严重，肝细胞排列结构紊乱，可见炎性细胞浸润，以汇管区为中心，出现不同程度纤维增生性改变;与模型组比较，经不同剂量大黄素治疗后，大鼠肝细胞破坏明显减轻，炎性细胞浸润减少，纤维增生性改变减轻，肝脏损伤程度呈现好转趋势。见图1。Masson染色结果显示，正常组大鼠肝组织结构正常，未见胶原纤维增生；模型组大鼠肝脏结构紊乱，伴假小叶形成，可见大量胶原纤维增生；不同浓度大黄素治疗组大鼠肝纤维组织增生均有不同程度的改善，肝组织结构趋向正常。见图2。

图1 5组大鼠肝组织HE染色结果 (100×)

图2 5组大鼠肝组织胶原纤维增生的情况(Masson染色，100×)

2.2 5组大鼠血清肝功能指标比较 与正常组大鼠相比，模型组大鼠血清ALT、AST水平升高，白蛋白水平降低(均P<0.05)；与模型组大鼠相比，大黄素各剂量组大鼠血清ALT、AST水平下降，白蛋白水平升高(均P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清肝功能指标比较(x±s)

2.3 5组大鼠血清肝纤维化指标水平比较 与正常组相比，其他各组大鼠血清中透明质酸、LN、Ⅳ型胶原和PCⅢ水平均升高(均P<0.05)，进一步表明肝纤维化模型制备成功；与模型组比较，大黄素各剂量组大鼠血清中透明质酸、LN、Ⅳ型胶原和PCⅢ水平均有不同程度的下降(均P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清肝纤维化指标水平比较(x±s)

2.4 5组大鼠肝组织CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA相对表达水平比较 与正常组相比，模型组大鼠肝组织中CTGF、TIMP-1 mRNA相对表达水平升高，MMP-9 mRNA相对表达水平降低(均P<0.05)；与模型组相比，大黄素各剂量组CTGF、TIMP-1 mRNA相对表达水平降低，MMP-9 mRNA相对表达水平升高(均P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠肝组织CTGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA相对表达水平比较(x±s)

3 讨 论

肝纤维化是由于各种因素(酒精、病毒、自身免疫等)导致肝星状细胞的激活，引起肝脏中胶原纤维为主的细胞外基质的合成与降解失调,从而导致纤维结缔组织在肝脏内过量堆积所致。HE染色常用来显示组织或细胞一般形态的改变，也是观察肝纤维化情况常用的染色方法之一；Masson染色则是显示纤维结缔组织的重要染色方法之一，其能较为准确地判断出组织纤维化的严重程度。此外，血清学指标透明质酸、LN、Ⅳ型胶原和PCⅢ水平在肝纤维化时明显升高，其水平的高低与肝纤维化程度呈正相关，是反映和监测肝纤维化发展的常用指标[13]。本实验采用四氯化碳-橄榄油复合法建立肝纤维化大鼠模型，病理学检测结果显示模型组大鼠肝小叶结构破坏严重、大量胶原纤维增生，且血清透明质酸、LN、Ⅳ型胶原和PCⅢ水平高于正常组(均P<0.05)，提示肝纤维化模型制备成功。而经不同剂量大黄素干预后，大鼠肝脏结构破坏不同程度减轻，胶原纤维增生减少，血清透明质酸、LN、Ⅳ型胶原和PCⅢ水平均有不同程度的改善(均P<0.05)，这提示大黄素对大鼠的肝纤维有一定的逆转作用。

ALT、AST是反映肝功能水平的基本指标，白蛋白常用来反映肝脏损坏的严重程度。本实验结果显示，与正常组比较模型组大鼠血清ALT、AST水平升高，白蛋白水平下降，大黄素给药干预后大鼠ALT、AST水平下降，白蛋白水平升高(P<0.05)，这提示大黄素对肝纤维化大鼠的肝功能损害有一定的改善作用。

CTGF主要由成纤维细胞等间质细胞合成，其在肝纤维化发生发展过程中起着重要的作用。动物及临床研究表明，发生纤维化的肝脏组织中CTGF表达显著增加[14-15]， 且CTGF可以促进细胞外基质的合成和成纤维细胞的增生[16]。MMP和TIMP是细胞外基质降解和重塑的关键因素。MMP-9可降解正常肝脏胶原基质，导致肝细胞内环境的破坏，进而促进肝星状细胞的活化，并分泌大量的胶原蛋白，促进肝纤维化的发展[17]。TIMP-1在肝纤维化进程中起着重要作用，可通过结合MMP-9的酶原形成复合物，从而抑制MMP-9活性，其水平可以反映肝纤维化的严重程度[18]。本实验结果显示，与正常组比较模型组大鼠CTGF、TIMP-1 mRNA表达水平升高，MMP-9 mRNA水平降低(P<0.05)，而经大黄素干预后，各剂量组大鼠CTGF、TIMP-1 mRNA表达水平较模型组均有不同程度的降低，MMP-9 mRNA表达水平升高(P<0.05)。这说明大黄素或通过抑制CTGF和TIMP-1的表达，同时提高MMP-9的表达来达到改善肝纤维化的作用。

综上所述，大黄素可抑制大鼠肝纤维化的发展，改善肝功能，其机制可能与抑制CTGF、TIMP-1的合成及促进MMP-9的表达有关。这也为大黄素干预肝纤维化提供了前期的理论基础，但其具体作用机制仍须进一步实验验证，从而为临床治疗肝纤维化提供新的可能。