乳酸菌发酵对六安瓜片茶抗氧化活性的影响

苏 博，付春情，韩旺旺，刘啸宇，陈凤瑞，姚沛琳，徐礼生，王文婷

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

六安瓜片为绿茶中的一种，研究表明，长期饮用该茶可以预防部分癌症，治疗心血管疾病，还具有减肥减脂、清热降火等功效[1]。六安瓜片的外形尤为独特，香高味醇，因此受到众多消费者们的青睐[2]。六安瓜片茶的化学成分中无机矿质元素含量较多，有机化合物如蛋白质、脂质、茶多酚、皂苷等则含量较少，具有一定的保健功能[3]。

乳酸菌是一类利用碳水化合物作为原料，发酵碳水化合物而产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称[4]。 研究证明，乳酸菌作为安全级菌株加入到食品中，能改善其营养价值和风味，延长其保质期，提高食品的商业价值[5]。茶饮料通常指的是将茶叶或者茶叶提取物进行多种工艺加工而成的饮品，具有饮用方便、天然营养、卫生安全、可口保健等特点[6]。随着乳酸菌发酵的茶饮料在市场中陆续出现，有关的研究报道也逐渐增加。曹振辉[7]对乳酸菌发酵茶饮料的发酵工艺等进行了研究。刘佳琦等[8]通过研究得出了利用乳酸菌发酵部分茶饮料的最佳操作条件，并且分析了发酵前后茶汁中的主要挥发性成分。

目前，关于乳酸菌发酵茶饮料的过程中发酵液抗氧化能力的变化规律的研究鲜有报道。本文以六安瓜片茶浸提液为基质，分别接种不同浓度的乳酸菌菌悬液进行发酵处理，检测发酵过程中发酵液的超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基等自由基清除能力以及还原力等指标，并分析发酵过程中茶汁发酵液抗氧化能力的具体变化规律，以期为后续发酵茶饮料的研发及功能性饮料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料

六安瓜片茶，产于六安市御茗湾茶业有限公司，生产日期为2019年4月10日。

1.1.2 实验菌株

植物乳杆菌7-1，宿州学院生物与食品工程学院微生物实验室提供。

1.1.3 主要试剂及设备

本研究所用试剂主要有:由国药集团化学试剂有限公司生产的焦性没食子酸、DPPH试剂、七水合硫酸亚铁、六氰合铁(III)酸钾、六水合三氯化铁、水杨酸等。实验所用的主要仪器与设备见表1。

表1 主要仪器与设备

1.2 实验方法

1.2.1 茶汁的制备

(1)浸提：料水比为0.5∶100、1.0∶100、1.5∶100，每种料水比都分别浸泡时长10 min、20 min、30 min。

(2)过滤：采用微孔膜过滤茶汁。

(3)杀菌：水浴90 ℃，杀菌10 min。

(4)优化：选取无饮食偏好的10名体验者组成实验感官评定小组，对茶汁的风味、色泽以及口感按照表3进行感官评分，实验重复3次进行，总分为100分；感官评分标准如表2所示。

表2 茶汁的感官评定表

1.2.2 乳酸菌悬液的制备

活化植物乳杆菌7-1，制备其菌悬液的具体方法参照张治锬的《抗生素药品检验》中所述的方法[9]。

1.2.3 发酵过程中茶汁还原力的测定

将三种不同菌液添加量的六安瓜片茶汁分别稀释10倍后各取1 mL加入到10 mL的离心管中，用文献[10]的方法测定茶汁的还原力，用蒸馏水作为空白对照。按吸光度值与还原能力成正比测定茶叶还原力。

1.2.4 发酵过程中茶汁DPPH自由基清除能力的测定

把不同加菌量的样品分别稀释10倍再各取100 μL加入到试管中，具体实验方法参考文献[11]。自由基清除率的计算方法：

清除率/%= (Ab-AS)/Ab×100

其中,Ab为空白管的吸光度值;As为样品管的吸光度值。

1.2.5 发酵过程中茶汁羟基自由基的清除能力的检测

本实验采用水杨酸法检测羟自由基的清除效力[12]。在25 mL的试管中按顺序加入9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水杨酸、适量的去离子水、8.8 mmol/L H2O2，得到混匀试剂，将混匀后的试剂再于37 ℃的恒温水浴锅中保存15～20 min，最后在510 nm波长处测吸光度值A0和Ax值，以不加H2O2的体系为A0测定时的参比溶液。Ax和Ax0测定时，以去离子水作为参照液。羟自由基的清除率的计算方法如下：

清除率/%=(A0+Ax0-Ax)/A0×100

1.2.6 发酵过程中茶汁超氧阴离子自由基清除能力的测定

本文采用邻苯三酚自氧化法对茶汁发酵过程中超氧阴离子自由基清除能力进行测定，实验方法按照文献[13]。其中HCl的浓度为0.01 mol/L。自由基清除能力计算公式如下：

清除率/%= (对照的自氧化率-样品的自氧化率)/对照的自氧化率×100

2 结果与分析

2.1 茶汁制备感官评定结果

经感官评定小组对于茶汁的感官评分，茶汁的感官评定得分表如表3所示，结果显示，料水比为1∶100，浸泡20 min为茶汁制备的最佳条件，并将此条件下制备的茶汁用于后续实验。

表3 茶汁感官评定得分表

2.2 乳酸菌发酵过程中六安瓜片茶汁还原力的变化

抗氧化活性同还原力具有一定的相关性，现阶段已被许多研究所证实[14]。抗氧化剂其自身具有一定的还原作用因而能够给出电子，自由基由于电子的存在而得到部分清除，实验结果以还原能力来表示，还原力与六安瓜片茶汁发酵液的抗氧化性成正比关系。在本实验中，六安瓜片茶汁中的抗氧化剂能够使铁氰化钾中的三价铁变成二价铁，而二价铁会与三氯化铁继续反应，生成的物质在700 nm波长处有最大吸光度值，所以吸光度值越大,则说明六安瓜片茶汁的还原能力越强。

六安瓜片茶汁发酵过程中还原力的变化情况可由图1看出，三种不同加菌量的六安瓜片茶汁在整个发酵过程中均呈现为前36 h逐渐上升后缓慢降低的趋势，但整个发酵过程中两种加菌茶汁还原能力始终低于未加菌茶汁，说明在整个发酵过程中未加菌茶汁的还原力稍强于加菌茶汁。

图1 乳酸菌发酵过程中还原力在六安瓜片茶汁中的改变

2.3 乳酸菌发酵过程中六安瓜片茶汁DPPH自由基清除能力的变化

DPPH乙醇溶液显紫色，当将抗氧化物质加入到DPPH乙醇溶液中后，孤对电子被配对后，原先的紫色液体则会逐渐转变为黄色液体且吸光度在517 nm波长处逐渐减小，减小的程度与自由基的清除能力密切相关[15]。六安瓜片茶汁发酵的过程中其DPPH自由基清除能力的变化如图2所示。

图2 乳酸菌发酵过程中DPPH自由基在六安瓜片茶汁中的清除能力

从图2可以看出，整个发酵过程中三种不同加菌量的六安瓜片茶汁的DPPH自由基清除能力总体变化不明显，但未添加菌液的茶汁的DPPH自由基清除能力略高于其他两种加菌茶汁。

2.4 乳酸菌发酵过程中六安瓜片茶汁羟自由基清除能力的变化

人体内存在一种活性氧为羟自由基，该自由基氧化性较强，可能会造成人体内许多病理变化，例如其较强的氧化性可能使生物体内的脂质、蛋白质等会受到损伤，并且还可能会引起细胞代谢紊乱或者衰老死亡等现象。在整个发酵过程中，三种不同加菌量的六安瓜片茶汁在发酵前48 h内其羟自由基清除能力均呈现上升趋势且加菌前后变化不明显，但48 h后三种六安瓜片茶汁自由基清除能力均呈现下降趋势，但总体来看加菌茶汁自由基清除能力低于未加菌茶汁，且菌液添加量为1%的茶汁清除能力下降程度高于5%添加量的茶汁如图3。结果表明，六安瓜片茶汁的羟自由基清除能力在乳酸菌的加入下无明显变化。

图3 乳酸菌发酵过程中羟自由基在六安瓜片茶汁中的清除能力

2.5 乳酸菌发酵过程中六安瓜片茶汁超氧阴离子自由基清除能力的变化

超氧阴离子属于生物体在代谢过程中产生的一种自由基，对脂质、核酸、蛋白质等生物大分子具有一定的破坏作用，它能够使大分子物质相互链接或者断裂，从而可能会引起细胞受损，导致机体发生病变或者坏死。人体内通常在正常情况下会存在一定数量的超氧阴离子，超氧阴离子在人体内会与羟基发生结合然后会致使细胞DNA发生损伤，该结果会损害人体机能健康[16]。三种不同加菌量的六安瓜片茶汁在发酵过程中超氧阴离子自由基清除能力的变化情况可由图4看出，在茶汁发酵的前36 h，三种六安瓜片茶汁自由基清除能力急剧上升后趋于平稳，但添加乳酸菌发酵的茶汁自由基清除能力始终低于未加菌茶汁，1%添加量的茶汁自由基清除能力低于5%添加量的茶汁。加菌茶汁的超氧阴离子自由基清除能力与未加菌的六安瓜片茶汁相比略低，但总体来看超氧阴离子自由基清除能力仍然保持较高水平。

图4 乳酸菌发酵对六安瓜片茶汁超氧阴离子自由基清除能力的影响

3 结 论

本实验结果表明，料水比为1∶100，浸泡20 min是六安瓜片茶汁制备的最佳条件。以该条件制备的六安瓜片茶汁作为培养基发酵乳酸菌，研究六安瓜片茶汁在60 h的发酵过程中其抗氧化活性的变化规律。结果表明，在发酵的前36 h，三种不同的六安瓜片茶汁的还原力、超氧阴离子自由基清除能力均呈现先急剧上升后逐渐下降或者趋于平稳的趋势，且加入乳酸菌的六安瓜片茶汁还原力、超氧阴离子自由基清除能力均低于未加菌茶汁。在整个发酵过程中，三种不同加菌量的六安瓜片茶汁的羟自由基清除能力在发酵的前48 h先急剧上升，后逐渐稳定，在48 h之前，三种不同加菌量的六安瓜片茶汁的羟自由基清除能力相差不大，但48 h后未加菌茶汁羟自由基清除能力还是略高于另外两种加菌茶汁。

综上可知，六安瓜片茶经乳酸菌发酵后其抗氧化活性有所降低但仍然保持较高水平，表明将乳酸菌加入茶汁这一工艺是可行的，不仅可以使茶汁具有乳酸菌特殊的营养功能，改善茶汁的风味，提高茶汁的附加值，同时也不会对茶汁自身的抗氧化活性造成较大影响。因此本研究可为发酵茶饮料研制及功能性饮料的开发提供一定借鉴。