晾制湿度对雪茄烟叶碳氮代谢关键酶活性及品质的影响

卢绍浩，张嘉雯，赵喆，钟秋，王俊，宋朝鹏，邹宇航，张华述，赵铭钦

1 河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；

2 四川省烟草公司德阳市公司，四川 德阳 618400

雪茄是由烟叶卷制的一种特殊烟草制品，具有香气醇厚丰满，吃味香苦透甜，满足感强的特点[1]。烟草调制作为烟叶生产工艺中的一个重要环节，合理的调制手段能在一定程度上弥补田间生长所带来的不足[2]。烟叶在调制期间发生的一系列酶促反应对温湿度条件十分敏感，适宜的温湿度能够改善烟叶的内在成分、外观质量和内在品质[3]。

碳氮代谢作为烟草生命活动中两大初生代谢过程，主要包括碳水化合物与含氮化合物分解、转化、消耗及积累，二者间协调程度对烟叶的内在品质具有重要影响[4]。调制过程中碳水化合物和含氮化合物发生显著变化，其中以淀粉和蛋白质变化最为明显。在烟草调制阶段淀粉含量由调制初期的29.3%降至5.52%，而蛋白质含量降解约75%，且淀粉和蛋白质的降解均与调制过程中的湿度紧密相关[5-6]。调制后烟叶残留的淀粉不利于烟叶品质和色泽的形成，而调制后蛋白质含量过高，燃吸时将会产生烧焦的羽毛味并产生辛辣感[7-8]。合理调控晾制过程中环境湿度对促进雪茄烟叶内碳水化合物和含氮化合物的转化及内在品质的提高具有重要意义。贺帆等[9]研究表明，密集烘烤低温中湿环境下烟叶中氮代谢相关酶能保持较高活性，有利于烟叶内含氮化合物的转化。王怀珠等[10]发现，低温低湿变黄，慢升温定色有利于保持较高碳代谢相关酶活性，调制后烟叶淀粉含量较低且各化学成分较协调。国内外学者就不同烘烤条件对烤烟碳水化合物和含氮化合物的影响进行了大量研究[11-12]，而对雪茄烟叶晾制过程湿度变化对烟叶品质的影响报道甚少。本试验通过研究晾制过程中不同湿度下雪茄烟叶碳氮代谢变化规律及相关酶活性的变化，旨在为优化雪茄烟叶调制技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验田土壤为水稻土，有机质3.01 g·kg-1，碱解氮120 mg·kg-1，速效钾89 mg·kg-1，速效磷38.1 mg·kg-1，pH 为5.8～7.0。试验品种为德雪1 号。

1.2 试验设计

试验于2019 年在四川什邡市大泉坑村雪茄烟叶生产基地（东经104°09′，北纬31°18′）进行。烟苗于4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm，按照当地优质雪茄烟叶生产技术规范统一管理，烟田施氮量为180 kg·hm-2（烟草专用复合肥），N：P2O5：K2O ＝1：0.5：3。采收时选取大田长势基本一致、叶片成熟度相对一致的烟株，以中部叶（第10-12叶位）为试验材料，将采收烟叶分别挂入高湿、中湿、低湿三种梯度的恒温恒湿箱中进行晾制，各处理重复3 次，温湿度设定见表1。分别在雪茄烟晾制的6 个时期（鲜烟S1、凋萎期S2、变黄期S3、变褐期S4、定色期S5、干筋期S6）取样，每次选取各处理烟叶30 片分成三份，一份用于烟叶含水率的测定；一份用锡箔纸和纱布包裹后放于液氮中，用于相关酶活性的测定；一份去除主脉和叶尖杀青后，将其烘干磨碎过60 目筛，用于化学成分的测定。

表1 晾制过程温湿度设定Tab. 1 Temperature and relative humidity during airing process

1.3 测定指标与方法

1.3.1 含水率测定方法

将整片烟叶叶尖1/3 处和叶基1/3 处去除，放入（100±1）℃的烘箱中，采用烘箱法[13]测定雪茄烟叶的含水率。

1.3.2 碳氮代谢关键酶活性及质体色素含量

淀粉酶（amylase，AL）、中性转化酶（neutral invertase，NI）、 硝 酸 还 原 酶（nitrate reductase，NR）谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性采用紫外分光光度法利用AL、NI、NR 及GS 活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定。叶绿素和类胡萝卜素含量采用丙酮浸提比色法[14]测定。

1.3.3 化学成分含量测定方法

总糖、还原糖、淀粉、总氮、烟碱、蛋白质含量采用流动分析法测定[15]。氨基酸含量采用紫外分光光度法利用氨基酸含量测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定。

1.3.4 物理特性及感官质量评价

烟叶物理特性参照吉书文等[16]方法检测。将不同湿度处理的烟叶卷制成单料烟，感官评吸鉴定聘请什邡雪茄厂顾问时向东教授为首的7 名评吸专家，依据《YC/T415—2011 烟草在制品感官评价方法》进行感官评吸鉴定[17]。

1.4 数据分析处理

采用Microsoft Excel 2007 进行数据整理及作图，运用SPSS 21.0 进行数据分析。

2 结果

2.1 晾制过程不同湿度对雪茄烟叶含水率的影响

由表2 可知，随着晾制的进行，不同处理雪茄烟叶失水速率均呈现“慢—快—慢”的下降趋势，水分含量逐渐降低。晾制过程中，T1 处理所处的晾制环境湿度较大，含水率始终保持在较高水平，而T3 处理湿度较低，烟叶水分散失过快，含水率较低，表明了晾制湿度的高低对烟叶水分的散失有一定影响。在变黄期开始烟叶含水率迅速降低，其中以T3 降幅最高，T1 次之，T2 最低，分别为63.77%、51.11%和50.93%。表明雪茄烟叶在变色期水分快速散失。

表2 不同晾制湿度对雪茄烟叶含水率的影响Tab. 2 Effect of air curing humidity on moisture content of cigar tobacco leaves

2.2 晾制过程不同湿度对雪茄烟叶碳氮代谢相关酶活性的影响

由图1 可知，烟叶中碳代谢相关酶NI 和AL 活性在晾制期间先升高后降低，而氮代谢相关酶NR和GS 活性一直呈下降趋势。不同湿度处理酶活性在晾制前期无显著差别，随晾制的进行差异逐渐增大，均以T2 处理最高。在晾制过程中各处理NI 活性均呈先上升后急剧下降的变化趋势（图1A），在定色期达到最高值，此时随湿度的降低烟叶内NI 活性分别为1554.99 μg·min-1g-1、1900.08 μg·min-1g-1和1245.78 μg·min-1g-1，且各处理差异显著；烟叶定色后（S5）NI 活性迅速降低，各处理差异不大。如图1B 所示，不同处理烟叶AL 活性具有相同的变化趋势，均呈单峰波动变化，在变褐期达到峰值，其中T1、T2 和T3 处理AL 活性分别比晾制初期升高了41.71%、94.84%和64.66%，之后活性逐渐下降；在干筋期之前T2 处理AL 活性均高于T1 和T3 处理，且与T1 处理达到显著差异，之后处理间差异减小。这说明碳代谢相关酶活性在T2 处理下较高，能够加强叶片内碳水化合物代谢，促进淀粉等大分子物质降解。

NR 和GS 是植物氮代谢的限速酶，对氮代谢的强弱起着关键作用。不同处理雪茄烟叶NR 活性具有相同的变化趋势（图1C），均呈下降趋势。在晾制凋萎期活性剧烈降低，以T3 处理降解幅度最大，T1处理次之，T2 处理最低，降解幅度分别为62.48%、53.67%和43.77%，处理间差异达到显著水平，之后各处理NR 活性趋于平缓且差异不大。与NR 活性相比，整个晾制期间，烟叶内GS 活性始终高于NR 活性（图1D），各处理GS 活性均呈下降趋势，且降幅较平缓。变褐期之前T2 处理烟叶GS 活性显著高于其他处理，之后至晾制结束各处理间无显著差异。表明在晾制期间氮代谢能力逐渐降低，而中湿度处理有利于烟叶酶活性相对提高。

图1 不同晾制湿度的雪茄烟叶NI(A)、AL(B)、NR(C)、GS(D)活性Fig. 1 Activities of NI(A), AL(B), NR(C) and GS(D) in cigar tobacco leaves with different air curing humidity

2.3 晾制过程不同湿度对雪茄烟叶碳水化合物含量的影响

如图2A 所示，不同湿度处理处理雪茄烟叶调制过程中总糖含量变化趋势一致，即呈逐渐下降趋势，且降解幅度较均匀。晾制初期，各处理间总糖含量差异不大，随着晾制的进行各处理总糖含量表现为T2＞T3＞T1，且差异显著。干筋期时随着湿度的降低总糖含量分别为0.66%（T1）、1.31%（T2）和0.96%（T3）。晾制期间还原糖含量与总糖含量变化基本一致，呈下降趋势（图2B），干筋期与晾制初期相比各处理下降幅度分别为77.11%（T1）、58.72%（T2）和68.13%（T3）。整个晾制过程中T2处理烟叶还原糖含量始终最高，在凋萎期和干筋期与其它处理差异显著。表明晾制期间烟叶内碳水化合物大量消耗，而中湿度处理的烟叶总糖和还原糖含量较高，能缓解碳水化合物的消耗，有利于提高调制后的烟叶品质。由图2C 可知，不同湿度条件下雪茄烟叶淀粉含量均呈下降趋势，在凋萎期内淀粉含量下降较快，之后趋于平缓，在相同时间内T2 处理淀粉含量均显著低于T1 和T3 处理。晾制结束（S6）时以T3 处理淀粉含量最高，T1 次之，T2 最低，分别为1.61%、1.29%和0.81%，这说明过高和过低的晾制湿度均不利于烟叶中淀粉的降解。

图2 不同晾制湿度对总糖(A)、还原糖(B)及淀粉(C)含量的影响Fig. 2 Effect of air curing humidity on contents of total sugar(A), reducing sugar(B) and starch(C)

2.4 晾制过程不同湿度对雪茄烟叶含氮化合物含量的影响

不同湿度条件下雪茄烟叶总氮含量在晾制过程中呈递减趋势（图3A），但变化幅度小。不同湿度条件下以T3 处理烟叶总氮含量降解最多，T2 处理烟叶总氮含量降解最少，整个晾制期间各处理总氮含量差异未达到显著水平，说明不同晾制湿度对总氮含量变化影响较小。由图3B 表明，晾制期间雪茄烟叶烟碱含量先升高后降低，各湿度处理烟叶均在变黄期达到峰值，此时T1、T2、T3 烟碱含量分别为4.88%、4.17%、3.61%，且处理间差异显著，之后烟碱含量随时间推移逐渐降低。晾制过程中3 个处理烟碱含量表现为T1＞T2＞T3，表明中湿度处理使烟叶中烟碱含量保持在较适宜的水平，有利于提高烟叶的感官品质。

晾制过程中蛋白质降解动态如图3C 所示。晾制结束时（S6），自高到低各湿度处理蛋白质含量降幅为18.00%～6.76%、18.00%～4.01%和18.00%～5.70%，分别降低了2.66 倍、4.49 倍和3.16 倍。晾制期间T2处理的烟叶蛋白质含量显著低于T1 和T3 处理。晾制过程中不同湿度条件下雪茄烟叶氨基酸含量呈单峰曲线变化（图3D），T1、T2、T3 各湿度处理的峰值均在变黄期，分别为106.49 μmol·mg-1、180.21 μmol·mg-1、142.47 μmol·mg-1，且达到了显著差异；相比于晾制初期各处理分别升高了1.81（T1）、3.07（T2）、2.42（T3）倍，之后含量逐渐降低。说明了T2 处理有利于蛋白质的降解，并且促进了氨基酸的积累。

图3 不同晾制湿度对总氮(A)、烟碱(B)、蛋白质(C)和氨基酸(D)含量的影响Fig. 3 Effect of air curing humidity on contents of total nitrogen(A), nicotine(B), protein(C) and amino acid(D)

2.5 晾制过程不同湿度对雪茄烟叶质体色素含量的影响

质体色素是评价烟叶可用性以及品质的重要指标之一，其降解产物与致香成分紧密相关。由表3 可知，随着晾制时间的增加，各处理叶绿素和类胡萝卜素含量均呈下降变化，其中类胡萝卜素降幅远小于叶绿素。各处理相比较，烟叶质体色素含量降幅表现为：T3＞T2＞T1，且整个晾制过程中T1 与T3 均达到显著差异水平，但T2 与T3 除个别时期外差异均不显著，表明在晾制过程中适当降低环境湿度有利于促进质体色素充分降解，从而提高雪茄烟叶品质。

表3 不同晾制湿度对质体色素含量的影响Tab. 3 Effect of air curing humidity on plastid pigment content

2.6 不同湿度对晾制后雪茄烟叶物理特性及感官质量的影响

从表4 可以看出，不同处理雪茄烟叶叶质量重、叶厚、拉力以及平衡含水率均以T2 处理最大，而含梗率则以T2 处理最小，这可能是调制期间中湿度条件适宜，可防止烟叶中的物质过度转化，使烟叶的厚度及叶质重均可保持在一个较高水平，以至于叶片含梗率相对较低。而高湿和低湿条件下叶片偏薄，这样会影响到烟叶的弹性及抗拉强度。因此，中湿度条件下烟叶的工业使用价值较高。由表5 可知，随着晾制湿度的增加，雪茄烟叶香气质、香气量、刺激性、燃烧性及总分呈现先增加后降低的趋势。表明适当增加晾制期间环境湿度有利于提升烟叶感官质量，主要表现在香气量足、香气质好、刺激性小及燃烧性高。

表4 不同晾制湿度雪茄烟叶物理特性比较Tab. 4 Comparison of physical characteristics of cigar tobacco leaves with different air curing humidity

表5 不同晾制湿度雪茄烟叶感官质量比较Tab. 5 Comparison of sensory quality of cigar tobacco leaves with different air curing humidity

3 讨论

烟草调制的实质是在人为给予特定的温湿度条件下烟叶脱水干燥与生理生化反应相统一的过程。在调制期间烟叶中蛋白质、淀粉、多酚和色素等大分子物质的降解是烟叶质量风格形成的关键[18]。与烤烟相比雪茄烟叶的晾制是烟叶自然凋亡的过程且环境条件温和，因此环境中的湿度对雪茄烟的质量形成具有极大影响。本试验表明，雪茄烟晾制期间湿度条件对烟叶化学成分有较大影响。晾制后的雪茄烟叶中色素含量不仅影响烟叶的外观质量，还直接或间接地影响烟叶的内在品质[19]。试验结果表明，雪茄烟叶质体色素在晾制期间含量逐渐降低，T3 处理叶绿素和类胡萝卜素含量降解幅度较大，说明在晾制过程中适当降低环境湿度有利于促进质体色素充分降解。烟叶糖含量是影响烟气醇和度和吃味的主要因素，水溶性糖含量高的烟叶富有弹性且色泽鲜亮，但淀粉含量过高会影响烟叶的燃烧速度和香吃味，越低表明转化为单糖越完全[20]。本试验结果表明，在晾制过程中雪茄烟叶水溶性糖及淀粉含量均呈下降趋势，说明晾制期间可溶性糖和淀粉作为呼吸作用的基础物质而被消耗。不同湿度比较，中湿度处理下烟叶总糖和还原糖含量较高，淀粉含量低，且与其它处理达到显著水平。过高和过低的湿度均不利于晾制期间水溶性总糖的积累以及淀粉的转化，从而对烟叶的香吃味和燃烧性有不良影响，这与柳昕等[21]在白肋烟上的研究结果相一致。可能是由于中湿度更有利于碳代谢的进行，淀粉酶以及转化酶活性较高，从而促进淀粉等大分子向小分子化合物的转化。

晾制后的雪茄烟叶作为直接卷制的雪茄原料，其烟碱含量对烟叶香味品质、风格程度和安全性有重要影响[22]。杨焕文等[23]研究表明，深色晾烟品种KY171 在晾制过程中烟碱含量先增加后降低。本试验表现出相似的变化规律，晾制期间不同湿度雪茄烟叶烟碱含量呈先升高后降低的趋势，均在变黄期达到峰值。这可能是由于呼吸作用导致干物质损失使其相对含量增加，而后期由于烟碱的降解致使含量降低[24]。本试验中随环境湿度增加，烟叶中烟碱含量逐渐增加，这与李宗平等[25]在白肋烟上的研究不同。原因可能是烟草生物碱属于植物次生代谢产物，是植物防御机制中的有效物质，而本试验烟叶所处在空间较小的密闭环境中，随湿度的增加，烟叶易发生霉变，导致烟叶需保持较高的生物碱含量来抵御环境胁迫[26]。同时湿度对生物碱代谢相关酶活性有一定影响，对烟碱含量造成差异[27]。高湿度下烟碱含量高使得抽吸时刺激性增强，产生辛辣味，低湿度下烟碱含量低则吸食淡而无味。中湿度条件下烟碱和总氮含量处于适宜的水平，能够给予吸食者以适当的生理强度和香吃味[28]。氨基酸对调制后烟叶的色泽、香味和抽吸感觉有重要影响。王树声等[29]研究表明烟叶中氨基酸含量与香气量和劲头有正相关关系，与刺激性和杂气呈负相关。李常军[30]等研究发现，烤烟在烘烤过程中氨基酸含量在变黄期增加，到定色期含量降低。本试验结果表明雪茄烟具有相似的规律，晾制前期蛋白质含量急剧降低，而此时氨基酸含量逐渐升高，这是由于水解酶使蛋白质降解成氨基酸，引起氨基酸含量的积累。后期蛋白质含量变化趋于稳定，而氨基酸含量则开始下降，这可能由于此时氨基酸自身发生降解，同时与糖发生非酶棕色化反应，致使含量降低[31]。高林等[32]研究表明，白肋烟在中湿度晾制条件下各种酶活性较高，烟叶内蛋白质降解量较大。这与本试验研究结果相一致，高湿或低湿条件下蛋白质含量在晾制期间一直保持在较高的水平，而氨基酸含量较低，说明高湿或低湿环境会使烟叶霉烂或干燥过快而降低蛋白酶活性，不利于烟叶中蛋白质的转化，从而使氨基酸含量较低[32]。中湿度环境硝酸还原酶活性较高，更有利于蛋白质的降解和氨基酸的形成。氨基酸含量较高时，在适宜的湿度条件下容易与糖类物质发生非酶促棕色化反应，进而提高烟叶香气物质的含量[21]。

AL 和NI 均是碳代谢中的关键酶类，其活性可作为衡量碳代谢强度的重要指标，可将烟叶生育期积累的淀粉、蔗糖等大分子催化水解为小分子化合物，同时NI 也参与细胞胁迫响应[33]，对烟草品质起着重要作用。本研究中，随着晾制的进行，环境温度逐渐增加，AL 和NI 活性提高，碳代谢强度增加，碳的固定和转化代谢提高；之后随着烟叶的缓慢死亡，酶活性逐渐丧失。NR和GS是氮代谢过程中十分重要的酶，其作为植物氮素同化水平的重要生理指标，用于氨基酸、蛋白质等含氮化合物的合成[34-35]。本试验结果表明，高湿度和低湿度处理均使碳氮代谢关键酶活性一直处于较低的水平，这是因为高湿度环境烟叶含水率较高，且随着晾制的进行温度升高，易导致烟叶霉变，而低湿度处理烟叶失水速率较快，因此两种条件下烟叶内活性氧大量增加，烟叶内酶系统紊乱，使烟叶碳氮代谢相关酶活性较低[36]。因此，晾制期间中湿度环境使酶活性相对较高，有利于提高烟叶碳氮代谢的能力，保持碳水化合物以及含氮化合物的充分转化，最终促使烟叶各化学成分协调，进而提高烟叶的内在品质。

4 结论

在晾制过程中，不同湿度雪茄烟叶AL 和NI 活性先升高后降低，而NR 和GS 活性逐渐降低；烟叶含水率、质体色素、碳水化合物、总氮、蛋白质含量呈下降趋势，烟碱和氨基酸含量呈先升高后降低的变化。处理间比较，中湿度条件下即湿度控制在凋萎期80%～85%、变黄期75%～80%、变褐期70%～75%、定色期65%～70%、干筋期45%～50%范围内，碳氮代谢酶活性以及水溶性糖和氨基酸含量最高，淀粉和蛋白质含量最低，从而有助于烟叶内碳水化合物及含氮化合物的转化，且总体物理特性较好，感官质量更优越，提高了调制后烟叶质量。本文研究了不同晾制湿度条件下雪茄烟叶碳氮代谢相关酶活性及化学成分的动态规律，为优化雪茄烟叶晾制工艺提供理论依据。