16 个雪茄烟品种的烟碱转化率及与发酵后烟叶TSNAs 含量的关系

周迪，孙雨琦，史宏志，杨兴有 ，周骏，鲁喜梅，白若石，阳苇丽，赵园园，秦艳青

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，郑州市金水区文化路95号 450002；

2 四川省烟草公司达州市公司，四川省达州市达川区七里沟 635000；

3 中国烟草总公司四川省公司，成都市高新区世纪城路936号 600041；

4 上海烟草集团北京卷烟厂有限公司，北京市通州区万盛南街99号 100024

近年来，随着社会经济的发展和消费水平的提高，雪茄的消费群体不断增大，国产雪茄产销量快速增长，对雪茄原料生产和供应提出了新的要求。优质雪茄烟叶不仅要具有良好的抽吸品质，更要具备低害安全特性。烟叶中生物碱的组成和含量对烟叶质量和有害物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）的形成具有重要影响[1]。烟草中生物碱的组成主要有四种，分别为烟碱（nicotine, NIC）、降烟碱（nornicotine, NOR）、新烟草碱（anatabine, ANAT）、假木贼碱（anabasine, ANAB）。正常情况下，烟碱含量占总生物碱的92%以上，降烟碱含量不会超过3%，但是在烟株群体中一些烟株会出现烟碱去甲基化酶的突变，使烟碱含量降低，降烟碱含量和比例增加[2]。关于烟碱转化问题已在白肋烟中已有很多研究[1-3]，但在雪茄烟中则鲜有报道。

生物碱是烟草特有亚硝胺的直接前体物，烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱可在烟叶调制和调制后过程中发生亚硝化反应分别形成（NNK）、亚硝基降烟碱（NNN）、亚硝基新烟草碱（NAT）和亚硝基假木贼碱（NAB）[4]，其中NNK 和NNN 已经被列为Ⅰ类致癌物[5]，对烟叶的安全性有重要影响[6]。前期研究表明，由于仲胺类的降烟碱比叔胺类的烟碱具有较大的不稳定性，更易发生亚硝化反应，因此烟碱向降烟碱转化导致降烟碱含量增高是白肋烟叶中 NNN和TSNAs 总量增加的主要因素[7-9]。通过烟碱转化性状的遗传改良、转化株的早期鉴别和去除、低转化品种选育和应用等措施来降低烟碱向降烟碱转化是降低白肋烟TSNAs 的有效途径[10-11]。我国种植雪茄的历史悠久，但在雪茄烟叶有害成分含量和烟叶减害研究方面的研究却仍然十分欠缺，雪茄品种烟碱转化问题的原因也不明确。前期初步检测结果表明，雪茄烟叶TSNAs 含量水平普遍较高，系统研究不同雪茄品种烟叶TSNAs 的含量及其与生物碱组成和含量等的关系，对于明晰造成TSNAs 含量增高的深层原因和采取有针对性的措施降低雪茄烟叶 TSNAs 含量，提高雪茄烟叶和制品的安全性具有重要意义。为此，我们在2016—2017 年在四川设置品种比较试验，系统分析测定了16 个雪茄烟品种调制后烟叶TSNAs 及生物碱和硝酸盐含量，进而分析了TSNAs 含量与前体物含量的关系，旨在为我国雪茄烟的品种筛选和优化，有效降低雪茄烟叶TSNAs 含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验中的雪茄品种由四川中烟工业公司长城雪茄厂和CDF 国际公司等单位提供，共计16 个烟叶品种，其中茄衣品种有Cuba4（CX1）、Havana92（CX2）、长城1号（GH-1）、长城2号（GH-2）、Besuki/No（BN）、Cuba-Brazil（CB），茄芯品种包括MNC、MSCA、MFZS、PC、MFPP、OLOR、NJ、DMD、MKK、CP2012。GH-1、GH-2 两个品种自2010 年开始引种在万源种植，后经过多年系统选择；CX1、CX2、BN、CB、MNC、MSCA、MFZS、PC、MFPP、OLOR、CP2012 等品种自2011 年开始引种在万源种植，后进行连续多年系统选择，NJ、DMD、MKK 三个品种自2015 年开始在万源引种种植。

表1 参试的雪茄品种名称与代号Tab. 1 Name and code of tested cigar varieties

1.2 试验方法

试验于2016 年设在四川达州市万源县，土壤肥力中等，有机质含量适中。各供试品种随机区组排列，重复3 次。按照雪茄烟生产技术栽培管理。烟叶采收后，在晾房进行晾制，晾制后的烟叶在自然条件下堆捂发醇3 周，每个处理均取中部叶2 kg 留样，烟叶去梗后切碎，冷冻干燥后磨碎，置于冰箱保存待测。

1.3 样品测定方法

1.3.1 生物碱成分测定

取各处理调制后烟叶，在碱性条件下，每个重复取200 mg 样品进行生物碱的提取，提取试剂为甲基叔丁基醚（MTBE）。提取后的样品通过Agilent 7890A型（美国Agilent Technologies 公司）气相色谱-氢火焰离子化检测器定量分析4 种生物碱（烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱）的含量并以其含量之和作为总生物碱含量，具体步骤参照行业标准YC/T383-2010。

烟碱转化能力用烟碱转化百分率表示, 即降烟碱含量占烟碱和降烟碱含量之和的百分比, 可由下式计算：

烟碱转化百分率 （PNC）= [降烟碱含量 /（烟碱含量+ 降烟碱含量）] ×100%

1.3.2 硝酸盐和亚硝酸盐的测定

采用浓H2SO4-水杨酸法测定烟叶NO3-N 含量，采用磺胺法测定烟叶NO2-N 含量[12]。

1.3.3 TSNAs 成分测定

烟叶样品在上海烟草集团北京卷烟厂检测TSNAs含量。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis Pico）；（MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）[3]。称取1.0000 g样品于50 mL锥形瓶，加入40 μL 4种氘代内标溶液和30 mL 100 mmol/L乙酸铵溶液，在室温下以转速200 r/min振荡萃取60 min后过0.45 μm水相滤膜，收集滤液采用LC-MS/MS检测TSNAs含量。4种TNSA含量之和即为TSNAs总量。

1.4 数据分析

采用Excel 2016 和Excel 软件进行数据分析和制图；使用SPSS 17.0 软件进行方差分析，用Duncan's对雪茄烟叶生物碱、氮氧化物和TSNAs 等指标进行方差分析和方差齐性检验。

2 结果与分析

2.1 不同雪茄品种TSNAs 及其前体物含量分析

2.1.1 不同雪茄品种生物碱含量和烟碱转化率分析

由表2 可知，不同雪茄品种烟叶生物碱含量存在显著差异。所有参试品种总生物碱含量范围为1.74%～6.05%，总生物碱的平均值为3.63%。烟碱含量变化范围为1.14%～5.42%，平均为3.02%，降烟碱含量的变化范围为0.11%～1.47%，平均值0.40%。四种生物碱以降烟碱变异性较大，品种间存在显著差异，新烟草碱和假木贼碱变异性较小。

表2 雪茄不同品种生物碱和硝酸盐含量及烟碱转化率Tab. 2 The content of alkaloids and nitrate and the conversion of nicotine in different cigars

雪茄烟叶中存在较为严重的烟碱转化问题，烟碱转化率范围为5.03%～53.12%，平均值为12.66%，品种间烟碱转化率的变异系数高达101.01%，说明在不同品种间存在着较大的差异。烟碱含量与降烟碱含量呈现相反的变化趋势。

从总体上看，茄芯品种与茄衣品种的TSNAs 前体物质存在显著的差异。与茄衣品种相比，茄芯品种的生物碱总量、烟碱含量、假木贼碱和新烟草碱含量的平均值较大，降烟碱含量和烟碱转化率的平均值较低，变异系数较小。表明茄衣品种总生物碱含量较低，但是烟碱转化率较高，平均降烟碱含量高于茄芯烟叶。

2.1.2 不同雪茄烟品种烟叶硝酸盐含量的差异

分析结果表明（表2），雪茄烟叶硝酸盐含量远远大于亚硝酸盐含量，不同雪茄品种硝酸盐含量变化范围相对较小，平均值为1260.95 μg/g，亚硝酸盐含量的平均值为28.62 μg/g，与降烟碱含量和烟碱转化率相比，硝酸盐和亚硝酸盐含量的变异系数在品种间的差异较小，这可能是由于试验的土壤条件和栽培管理较为一致，而硝酸盐和亚硝酸含量受栽培条件影响相对较大。所有品种中，BN 硝酸盐含量最高，其次为DMD，以OLOR 品种的硝酸盐含量最低。

2.2 不同雪茄烟品种烟叶TSNAs 含量分析

由表3 可知，不同雪茄品种的TSNAs 含量及组成具有显著差异，不同雪茄品种的TSNAs 变异范围为181.74～7759.1 ng/g，平均值为3010.98 ng/g。TSNAs各组分平均含量以NNN 含量最高，平均值为1616.59 ng/g，且NNN 含量的变异性最大，从最小值的90.03 ng/g 到最大值的6643.86 ng/g，变异系数为0.97， NNN 含量的变化趋势与降烟碱含量和烟碱转化率一致，表明烟碱转化导致降烟碱含量增高与NNN 含量增加密切相关。

表3 不同雪茄品种TSNAs 含量及其比值比较Tab. 3 Comparison of TSNAs content and ratio of different cigar varieties

分 析4 种TSNAs 占 总TSNAs 的 比 例 可 知，雪茄烟叶中NNN 和NAT 平均值分别为49.26%和39.57%，所占比例较高，是主要的TSNAs， 但不同雪茄品种NNN 和NAT 占TSNAs 的比例差异显著，其中NNN 百分比的变异范围最大，为33.14 % ～85.63%，其受品种烟碱转化率的强烈影响，在高烟碱转化率品种中NNN 占比极高。NAT 百分比的变异范围为32.20%～54.68%。NNK 占总TSNAs 的比例平均为9.39%，以NAB 所占比例最低。

比较茄衣和茄芯两类品种可知，茄衣品种的TSNAs、NNN 含量显著高于茄芯，NAT、NNK 和NAB 含量低于茄芯。茄衣和茄芯品种的TSNAs 含量平均值分别为3404.07 ng/g 和2775.12 ng/g。茄衣品种的NNN 含量平均值为2227.22 ng/g，是茄芯NNN含量的1.78 倍。茄衣品种NNN/TSNAs 的平均值为也高于茄芯品种。

2.3 TSNAs 与生物碱、硝酸盐含量之间的相关性分析

对所测数据进行相关性分析，得到了不同雪茄品种TSNAs 与其前体物质之间的相关关系（表4）。由分析结果可知，NNN 与降烟碱含量和烟碱转化率之间呈极显著正相关关系，相关系数分别为0.802 和0.794。TSNAs 与降烟碱和烟碱转化率之间也存在极显著相关关系，相关系数分别为0.676 和0.672。NNN 含量与总TSNAs 含量相关系数高达0.942，表明NNN 含量对总TSNAs 含量贡献很大，NNN 含量增高是造成总TSNAs 含量增高的主要原因。此外，NAT 含量与新烟草碱和总生物碱总量相关系数也比较大。NNK 含量与烟碱呈极显著正相关，与降烟碱和烟碱转化率呈极显著负相关。烟碱与烟碱转化率和降烟碱含量之间呈负相关关系。硝酸盐与亚硝酸烟之间存在极显著正相关关系。

表4 雪茄烟 TSNAs 含量与生物碱、硝酸盐含量的相关系数Tab.4 Correlation coefficient between TSNAs content and alkaloid and nitrate content in cigars

图1 NNN 与降烟碱含量的相关关系Fig.1 Correlation between NNN and nornicotine content

图2 NNN 与烟碱转化率的相关关系Fig.2 Correlation between NNN and nicotine conversion rate

3 讨论

生物碱是雪茄烟叶中一类核心化学成分，生物碱的组成和含量不仅直接影响雪茄的生理强度、满足感、香吃味等感官质量，而且作为烟草特有亚硝胺等有害物质的直接前体物对其形成和积累有重要影响[1,14-15]。本试验通过对我国引进的代表性雪茄品种进行分析测定，观察到雪茄烟叶普遍存在烟碱向降烟碱转化问题，一些雪茄品种调制和发醇后烟叶的平均烟碱转化率和降烟碱含量很高，表明烟株群体中存在大量烟碱转化能力很强的转化株。由于仲胺类的生物碱具有较大的不稳定性，降烟碱极易与亚硝酸发生亚硝化反应生成NNN，并导致总TSNAs水平增高[1,16]，本试验相关分析表明，雪茄烟叶中NNN 和总TSNAs 含量与烟碱转化率和降烟碱含量存在极显著正相关关系，因此，在同一栽培、调制和发醇条件下烟碱向降烟碱转化导致降烟碱含量异常增高是雪茄烟叶NNN 含量和总TSNAs 含量升高的主要原因。根据前人研究结果[16]，烟碱转化产生的降烟碱多为S 构型，由其产生的S 构型NNN 具有更大的危害性，所以在转化株中形成的TSNAs 有害性很大。烟碱转化性状是一种显性遗传，有效鉴别和去除转化株可以使烟株群体得以优化，选育低烟碱转化率雪茄品种，或者对现有雪茄品种进行纯化改良是降低雪茄烟叶TSNAs 含量的重要途径[17]。

在雪茄烟中，四种TSNAs 中以NNN 和NAT 含量相对较高，其次为NNK，以NAB 含量最低，在非转化株的烟叶中，NAT 含量一般高于NNN 含量，而在转化株烟叶中，由于NNN 的大量形成，致使NNN 的含量远远高于NAT，因此，NNN/NAT 的值和占总TSNAs 的比例与烟碱转化率密切相关[18]。本试验所试茄衣品种和茄芯品种总生物碱含量有一定差异，茄芯品种平均生物碱含量水平相对较高，但茄衣品种的烟碱转化率和降烟碱含量高于茄芯品种，进而使NNN 含量形成增多，导致烟叶NNN 含量和总TSNAs 含量的平均值较高。关于茄衣品种烟碱转化率高的原因可能主要是不同品种基因型造成的，有待进一步研究。本研究表明NNN 含量与降烟碱关系显著，但NNK、NAT、NAB 与相应的前体物相关性较小，这可能是因为各TSNAs 合成之间存在竞争。根据蔡斌等人的研究结果[16]，NNK、NAB 和NAT的含量受NNN 影响，即降烟碱可以和其它三个生物碱竞争亚硝化反应，所以当烟碱转化率较高时，其它三个生物碱与其亚硝化产物的相关性降低。本试验中，雪茄烟叶内的硝酸盐与和亚硝酸盐与TSNAs含量之间的相关性较小，与之前研究报道有所不同[19-20]，本研究是在生态环境和栽培条件一致的条件下研究品种间的差异，由于烟碱转化性状是遗传突变造成的，因此烟碱转化导致的NNN 含量相应增加也是遗传因素引起的结果，烟叶硝态氮含量受施氮量、氮素形态等栽培因素的强烈影响，因此，在栽培条件相对一致的试验条件下，硝态氮含量变化较小，其对TSNAs 形成的影响容易被遗传因素形成的影响而掩盖。

4 结论

雪茄烟品种不同程度上存在烟碱向降烟碱转化问题，品种间降烟碱含量和烟碱转化率存在显著差异。雪茄烟叶样品NNN 和TSNAs 含量与降烟碱含量和烟碱转化率存在极显著的正相关关系，烟碱转化导致降烟碱含量增高是雪茄烟叶NNN 和TSNAs 含量增高的直接原因，对雪茄品种进行烟碱转化性状改良是降低雪茄烟叶TSNAs 含量的有效途径。