姜黄素烟酸酯对辐射诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-18表达的影响*

（南华大学附属第二医院 血管外科，湖南 衡阳 421001）

放疗所致颈动脉炎是头颈恶性肿瘤放疗患者卒中新的独立危险因素。放疗会造成照射野内血管损伤，其动脉损伤导致动脉血管狭窄会引起患者出现一过性黑朦、轻瘫、感觉障碍等症状，严重狭窄会增加发生脑血管事件的风险[1-3]。因此，早期减轻放疗性颈动脉炎，可减缓颈动脉狭窄发展进程，从而降低脑卒中发生率。放射线对血管内皮损伤致巨噬细胞的活化是放疗后动脉炎发生的关键因素。研究发现，辐射刺激可诱导巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化，从而促进细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-18[4]。姜黄素烟酸酯是姜黄素和烟酸两者结合形成的新型化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、免疫调节等诸多药理作用。研究表明，姜黄素在炎症疾病中能起到良好的抗炎作用[5-6]。因此，本实验以巨噬细胞作为模型，通过射线照射巨噬细胞，以姜黄素烟酸酯干预，观察其对放疗后炎症介质释放的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

姜黄素烟酸酯由湖南中医药大学庹勤慧老师赠送，将其溶于二甲基亚砜 （DMSO） 中，储液浓度为1.0 μmol/L。实验所用一抗为多克隆兔抗人白细胞介素-1β （IL-1β） （ab2105） 、兔抗人白细胞介素-18 （IL-18） （ab71495） 、鼠抗人β-actin （ab8227） 购自美国Abcam公司，巨噬细胞 （RAW264.7） 由南华大学附属第二医院临床实验中心所有，高糖DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天有限公司，Western blotting 发光液购自北京英格恩生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自广州七星生物科技有限公司，Siemens Primus 直线加速器购自德国西门子公司，参数设定为6 MVX，吸收剂量为200 Gy/min，源皮距为100 cm。

1.2 方法

1.2.1 照射剂量常规对RAW264.7 细胞进行培养，取对数生长期细胞进行实验。RAW264.7 细胞的照射剂量为200 Gy/min。将处于对数生长期的RAW264.7 细胞给予不同剂量 （0、2、4和8 Gy） 的照射，照射完毕后，提取细胞总蛋白，应用Western blotting 检测IL-1β、IL-18的表达。

1.2.2 细胞分组分为空白对照组 （0.0 μmol/L） 、单纯照射组 （Vector） 、姜黄素烟酸酯不同浓度组 （1.0、3.0和9.0 μmol/L）。空白对照组和单纯照射组照射前不给予药物干预，姜黄素烟酸酯不同浓度组照射前1 h 预先给予不同浓度的姜黄素烟酸酯，照射后24 h提取细胞总蛋白行进一步检测。

1.2.3 Westernblotting 检测照射后24 h 收集各组细胞，提取细胞总蛋白，蛋白定量检测按BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行操作。取25 mg 蛋白上样进行SDSPAGE 电泳，80 V 稳压转膜，以含5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育后，洗膜加入相应辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h，电化学发光 （ECL） 法检测。以β-actin作为内参。

1.2.4 CCK-8实验取对数生长期RAW264.7 细胞消化后进行稀释，并计算浓度，按10 000个/孔细胞接种于64孔板中，每组设置3个复孔。贴壁过夜后去除培养基，加入根据实验需要配置的梯度浓度姜黄素烟酸酯，每孔100 μl。24 h后，弃培养基，每孔加入新鲜培养基100 μl及CCK-8 试剂10 μl，注意不要留有气泡。培养板置于细胞培养箱中37℃培养30 min，然后立即取出置于酶标仪，于波长450 nm处检测吸光度值，以3个复孔平均值作为每个样本最终结果，实验重复3次，根据说明书计算生存分数。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）表示，比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 最适照射剂量

射线照射后内IL-1β、IL-18的蛋白表达水平升高 （见图1、2）。以0、2、4和8 Gy 剂量放射线照射RAW264.7 细胞后，各组IL-1β的蛋白表达水平分别为 （0.157±0.009） 、 （0.387±0.010） 、 （0.437±0.010）和 （0.396±0.010），经单因素方差分析，差异有统计学意义 （F=436.534，P=0.000）。2、4和8 Gy组分别与0 Gy组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。各组IL-18的蛋白表达水平分别为 （0.899±0.004） 、 （1.074±0.044） 、 （1.375±0.038）和 （1.240±0.041），经单因素方差分析，差异有统计学意义 （F=74.762，P=0.000）。2、4和8 Gy组分别与0 Gy组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。IL-1β、IL-18表达水平在0～4 Gy 照射剂量范围随照射剂量增加而升高，而8 Gy 照射后有所下降，因此4 Gy 是最适照射剂量。

2.2 姜黄素烟酸酯对照射后RAW264.7 细胞IL-1β、IL-18蛋白表达的影响

行CCK-8 实验检测姜黄素烟酸酯不同浓度组生存率，结果显示各组生存率＞80%。见图3。

图1 不同剂量放射线照射后RAW264.7 细胞的IL-1β 蛋白表达

图2 不同剂量放射线照射后RAW264.7 细胞的IL-18蛋白表达

图3 不同浓度姜黄素烟酸酯对RAW264.7 细胞毒性的影响 （±s）

照射前1 h分别给予1.0、3.0和9.0 μmol/L 姜黄素烟酸酯，再经最适照射剂量4 Gy 照射，24 h后提取蛋白，空白对照组 （0.0 μmol/L） 、单纯照射组 （Vector） 、姜黄素烟酸酯不同浓度组 （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-1β的蛋白表达水平分别为 （0.244±0.008） 、 （0.580±0.012） 、 （0.419±0.012） 、 （0.333±0.025）和 （0.439±0.003），经单因素方差分析，差异有统计学意义 （F=235.134，P=0.000），各组IL-1β的蛋白表达水平分别与空白对照组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05），各组IL-1β的蛋白表达水平分别与单纯照射组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。见图4。

由图5示：空白对照组 （0.0 μmol/L） 、单纯照射组 （Vector） 、姜黄素烟酸酯不同浓度组 （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-18的蛋白表达的水平分别为 （0.454±0.006） 、 （0.711±0.010） 、 （0.463±0.016） 、 （0.385±0.018） 及 （0.361±0.023），经单因素方差分析，差异有统计学意义 （F=182.243，P=0.000）。各组IL-18的蛋白表达水平分别与空白对照组比较，除1.0 μmol/L组差异无统计学意义 （P＞0.05），其余组差异有统计学意义 （P＜0.05） ；各组IL-18的蛋白表达水平分别与单纯照射组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。

图4 各组RAW264.7 细胞IL-1β 蛋白的表达

图5 各组RAW264.7 细胞IL-18蛋白的表达

3 讨论

放疗引起的血管损伤机制是放射线导致内皮细胞的炎症反应，释放炎症介质导致动脉炎性损伤。抑制巨噬细胞的活化、减少炎症因子释放，可减轻放射性动脉损伤，延缓颈动脉狭窄的发生。研究表明抗炎、抗氧化、抗免疫调节是姜黄素诸多药理作用之一[7]。JAIN 等[8]研究表明，在姜黄素干预后糖尿病大鼠的炎症因子TNF-α、IL-6表达水平下降。姜黄素的缺点是其体内代谢消除快、生物利用度低，临床应用受到限制。调节炎症因子药物烟酸单用有皮肤潮红、瘙痒、肝功能损害等副作用。因此，将姜黄素和烟酸两者结合形成新型化合物姜黄素烟酸酯，可充分发挥烟酸的调节炎症因子以及姜黄素的抗炎作用，可提高其生物利用度，减轻副反应。因此，本实验从细胞层面探讨姜黄素烟酸酯对炎症因子IL-1β、IL-18的抑制作用，证明其可作为辐射防护药物。

本研究结果显示，巨噬细胞在受到射线照射后，随着照射剂量的增大，细胞IL-1β、IL-18蛋白的表达升高，于4 Gy 照射剂量时达到峰值，但是当照射剂量达8 Gy时，IL-1β、IL-18的蛋白表达反而下降，究其原因可能为大剂量射线照射时细胞损伤增加，从而影响细胞的活性进而导致IL-1β、IL-18的蛋白表达降低，因此4 Gy 是其最适照射剂量。在4 Gy 射线照射前预先给予不同浓度的姜黄素烟酸酯，随着姜黄素烟酸酯剂量增加，IL-1β、IL-18的蛋白表达水平降低，提示姜黄素烟酸酯可减少辐射诱导的IL-1β、IL-18的表达，减轻细胞的炎症反应，对细胞具有保护作用。

本研究中未涉及细胞培养基中分泌型IL-1β、IL-18表达的检测，这也正是本课题组进一步研究的内容。包括放疗前后及姜黄素烟酸酯干预处理后培养基中IL-1β、IL-18表达的变化；同时，可以收集临床患者接受放疗前后的血清，检测IL-1β、IL-18的表达变化。

综上所述，研究发现4 Gy 照射巨噬细胞可诱导细胞IL-1β、IL-18的蛋白表达，一定剂量的姜黄素烟酸酯可降低辐射后巨噬细胞IL-1β、IL-18的蛋白表达水平，抑制炎症反应，具有较好的辐射防护作用。