神经酰胺合酶-神经酰胺通路在青蒿琥酯抑制肝纤维化中的作用*

阮建佳，杜 岩

(1. 天津市蓟州区人民医院综合内科，2. 天津市蓟州区人民医院药剂科，天津 301900)

肝纤维化[1]是肝脏受到损伤后自我修复过程的代偿反应，其中肝星状细胞的活化增殖与肝纤维化密切相关，正常肝脏中肝星状细胞呈静息的状态，当受到损伤后，便出现活化增殖，转变成肌成纤维细胞，细胞外基质增多，促使肝纤维化形成，故而治疗肝纤维化的重点在于阻碍肝星状细胞增殖以及加速其凋亡。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，具有抗病毒、调节免疫、解毒保肝等药理作用，青蒿琥酯(artesunate, Art)具有抗肝纤维化作用，能降低羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量，应用青蒿琥酯后肝星状细胞中神经酰胺(ceramide, Cer)的水平发生变化，神经酰胺[2-4]为神经鞘脂类，与细胞的分化、增殖、凋亡活动密切相关，神经酰胺合酶为神经酰胺合成中的关键酶，选用神经酰胺合酶阻断剂伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)来阻断神经酰胺合酶的合成，进而探讨青蒿琥酯抑制肝纤维化过程中神经酰胺合酶-神经酰胺通路的作用。

1 材料与方法

1.1 实验对象

人源肝星状细胞株 LX-2由天津医科大学提供。

1.2 主要试剂及仪器

青蒿琥酯由桂林南药有限公司提供；神经酰胺购自Sigma公司；Fumonisin B1购自Sigma公司；Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology公司；神经酰胺合酶2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)抗体购自SANTA CRUZ公司；羟脯氨酸测定试剂盒购自南京建成试剂公司；过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ, PPAR-γ) 购自Santa cruz公司； DYCZ-40D型转膜仪购自北京市六一仪器厂；B600型低速自动平衡离心机购自河北省安新县白洋离心机厂；HZS-H型水浴振荡器购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.3 实验设计及实验分组

将LX-2细胞放置在37℃饱和湿度，5 %CO2细胞培养箱里进行培养，培养至约80%融合时，弃去旧培养基，用PBS冲洗3次，再加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化1 min，然后进行细胞传代，取对数生长期细胞进行后续实验。实验分为四组：(1)Control组：细胞用正常培养基培养24 h，不进行任何处理；(2)Art处理组：细胞用Art 350 μmol/L处理24 h；(3)FB1处理组：细胞用FB1 6 μmol/L处理24 h；(4)Art 与FB1联合处理组：细胞用Art 350 μmol/L+FB1 6 μmol/L处理24 h。各组均设计7个复孔，作用24 h结束后，收集LX-2细胞及细胞上清液进行检测。

1.4 Western blot检测LASS2、PPAR-γ 及Caspase-3蛋白的表达

将LX-2细胞接种于6孔板中，按上述实验设计进行处理，提取细胞蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白的浓度。取35 μg上样，30%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h后，全湿式电转法转膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，分别加入LASS2(1∶500)、PPAR-γ(1∶500)及Caspase-3(1∶1 000)抗体于4℃孵育一夜，TBST洗膜3次，室温下孵育二抗2 h，TBST洗膜3次，ECL发光液显色之后曝光。采用Quantity One软件进行条带灰度值分析。

1.5 HPLC-FLD法测定神经酰胺的含量

将LX-2细胞接种于96孔板中，各组根据实验设计进行处理，作用24 h后，收取上清液100 μl，加入等量的乙腈，13 000 r·min-1离心3 min。吸取上清液储存于4℃冰箱中，检测方法参考文献[5](测定生物样本中神经酰胺含量的HPLC-FLD法)。

1.6 MTT法检测LX-2的增殖情况

将LX-2细胞接种于96孔板中，各组根据实验设计进行处理，作用24 h后，每孔加入MTT 10 μl，作用4 h后，弃净培养基并吸干，每孔加入二甲基亚砜200 μl，置于酶标仪中570 nm测定各孔吸光度值(A值)，按以下公式计算细胞抑制率(Inhibition Rate，IR)，抑制率(%)=[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100%。

1.7 测定羟脯氨酸含量

将LX-2细胞接种于96孔板中，各组根据实验设计进行处理，作用24 h后，留取细胞上清液，按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书操作。计算公式：羟脯氨酸浓度(μg/ml)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管浓度(5 μg/ml)×样本测试前稀释倍数。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 Art对LX-2细胞LASS2蛋白表达的影响

与细胞对照组比较，Art可以增加LX-2细胞LASS2的表达，FB1可减少LX-2细胞LASS2的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)；与Art单用组比较，FB1与Art合用组LX-2细胞的LASS2的表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 Art对LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表达的影响

与细胞对照组比较，Art可显著增加LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白的表达，FB1处理组，LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表达减少，具有显著性差异(P<0.05)。与Art单用组比较，FB1减弱Art对LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表达升高的作用，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3 Art对LX-2细胞分泌神经酰胺的影响

与细胞对照组比较，Art可以增加LX-2细胞神经酰胺的分泌，FB1可减少LX-2细胞神经酰胺的分泌，差异具有统计学意义(P<0.05)；与Art单用组比较，FB1与Art合用组LX-2细胞的神经酰胺的分泌显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.4 Art和FB1对LX-2细胞增殖的影响

MTT结果显示：与细胞对照组比较，Art对LX-2细胞的增殖有显著的抑制作用，FB1可促进LX-2细胞的增殖，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与Art单用组比较，FB1与Art合用组，可降低Art对LX-2细胞的增殖抑制作用，差异具有统计学意义(P< 0.05，表2)。

2.5 Art和FB1对LX-2细胞羟脯氨酸水平的影响

与细胞对照组比较，Art可降低LX-2细胞羟脯氨酸的分泌，FB1增加LX-2细胞羟脯氨酸的分泌，差异具有统计学意义(P<0.05)；与Art单用组比较，FB1与Art合用可以减弱Art对LX-2细胞羟脯氨酸分泌的抑制作用，差异具有统计学意义(P< 0.05，表2)

3 讨论

肝星状细胞的增殖与活化是肝纤维化发生的关键环节，抑制其增殖，促进其凋亡是我们研究的重点，前期实验青蒿琥酯作用于肝星状细胞后，其增殖受到抑制，并在实验中发现应用青蒿琥酯后神经酰胺的水平发生变化[6]。青蒿琥酯如何调控神经酰胺的水平进而发挥抗肝纤维化的作用成为研究的关键。神经酰胺[7]，是细胞膜中神经鞘磷脂经水解产生的脂质分子，可参与调节细胞的增殖、凋亡等活动，调控神经酰胺的关键酶是：(1)酸性、中性、碱性鞘磷脂酶，可通过参与鞘磷脂水解过程产生神经酰胺；(2)丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyl transferase, SPT)是神经酰胺从头合成途径的关键酶；(3)神经酰胺酶可参与神经酰胺向鞘氨醇的转化；(4)神经酰胺合酶[8]可促进鞘氨醇向神经酰胺的转化。在哺乳动物中神经酰胺合酶存在六种类型，LASS1-6，其中LASS2对神经酰胺的合成最为重要，且在肝脏中含量很高，故本实验选用LASS2为神经酰胺合酶的研究对象，选用神经酰胺合酶抑制剂Fumonisin B1[9]来阻断神经酰胺合酶研究青蒿琥酯抑制肝纤维化中神经酰胺合酶-神经酰胺信号通路对肝星状细胞增殖及凋亡的影响。

实验结果显示应用神经酰胺合酶阻断剂FB1后，与细胞对照组比较，LX-2细胞的神经酰胺合酶LASS2的表达减少并且神经酰胺水平下调，青蒿琥酯可提高LX-2细胞LASS2的表达并提高神经酰胺水平，且FB1与Art合用，发现FB1可以减弱Art对LX-2细胞LASS2蛋白表达及神经酰胺水平升高的作用，证实Art发挥抗肝纤维化的作用与神经酰胺合酶-神经酰胺通路有关，揭示Art可能是通过调控神经酰胺合酶蛋白表达，进而影响LX-2细胞的增殖及凋亡。

PPAR-γ属核受体家族成员，正常肝脏的肝星状细胞中PPAR-γ表达增加，当受到损伤或发生炎症时，随着肝星状细胞的持续活化，PPAR-γ的表达逐渐减弱[10-11]，PPAR-γ对抑制肝星状细胞的增殖活化有调节作用。并有研究证实神经酰胺可促进PPAR-γ的表达，进而减少肝脏脂肪病变[12]。神经酰胺能够增加肝癌细胞PPAR-γ的转录活性，细胞周期阻滞，抑制肝癌细胞生长[13]。本实验旨在研究肝纤维化中神经酰胺对于肝星状细胞增殖及凋亡的调控，实验结果显示Art可显著增加LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3的蛋白表达，FB1与Art合用组与Art单用组比较，LX-2细胞PPAR-γ、Caspase-3的表达上调作用明显减弱，验证Art可通过神经酰胺合酶-神经酰胺通路上调PPAR-γ及Caspase-3蛋白的表达，抑制LX-2细胞的增殖并促进其凋亡。

Tab. 1 Effects of Art and FB1 on the expressions of LASS2, PPAR-γ and Caspase-3 protein n = 7)

Tab. 2 Effects of Art and FB1 on the concentration of ceramide, the inhibition rate of LX-2 and the level of hydroxyproline n = 7)