小剂量辣椒素抗小鼠肺纤维化的作用及其机制*

卢林明，俞婷婷，何晓伟，汤 娟，李先伟△

(1．皖南医学院病理学教研室，安徽 芜湖 241002； 2．皖南医学院医学机能学实验实训中心，安徽 芜湖 241002； 3．皖南医学院药理学教研室，安徽 芜湖 241002)

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是一种以成纤维细胞(或)肌成纤维细胞群异常扩增、肺组织结构重塑为特征的慢性进行性疾病，其发病机制至今仍未阐明[1]。其主要病理表现为结缔组织生长因子和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)表达上调、肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFb)增多及细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)沉积增加，其中MFb的活化诱导的EMC加速沉积是导致肺纤维化的重要因素[2]。目前研究发现，肺纤维化时MFb可能来源于间质细胞增殖、上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)和骨髓来源的循环纤维细胞，其中TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT是MFb的主要来源[3]。Gao[4]等人研究发现TGF-β1诱导的EMT与其上调真核翻译起始因子3a(eukaryotic initiation factor 3a,eIF3a)有关。而我们前期研究也发现采用大剂量辣椒素(50 ml/kg)耗竭内源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)能够加重博莱霉素(bleomycin, BLM)诱导的大鼠肺纤维化[5]；而外源性CGRP通过抑制eIF3a的表达、上调p27的表达而抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT的产生，进而抑制了MFb的增殖活化[6]。由此可见，调节内源性CGRP的释放在一定程度上能够缓解肺纤维化的发生与发展。

辣椒素(capsaicin, Cap)是从辣椒提取的主要活性成分，具有镇痛、抗炎、抗纤维化等作用[7]。Xu等人研究发现Cap通过激动瞬时电位感受器香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)抑制人乳头状甲状腺癌细胞EMT，进而抑制肿瘤细胞的的粘附、迁移和侵袭[8]。Qu[9]等人研究发现Cap通过激动TRPV1受体，释放扩血管物质P物质而缓解野百合碱诱导的肺动脉高压。而Li[10,11]等人研究发现Cap是通过激活TRPV1 而产生NO、CGRP 而产生心血管保护作用。基于以上的研究背景，本研究拟探讨小剂量Cap是否通过激动TRPV1，促进内源性CGRP的释放，抑制肺泡上皮细胞EMT而缓解BLM诱导的PF。从而为肺纤维化发病机制提供新的理论依据，并为研发治疗肺纤维化的药物提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周年雄性BALB/c小鼠，体质量20～25 g，购于南京青龙山动物养殖场(许可证号：SCXK(浙)2018-0012)。

1.2 药物及试剂

辣椒素(capsaicin，Cap，美国MedChemExpress公司，产品编号HY-10448)。TRPV1受体阻断剂SB-452533(美国SIGMA公司，产品编号SML0890)。博莱霉素注射液(日本化药株式会社，产品编号970592)。改良 Masson 三色染色液(北京博奥森生物技术有限公司，产品编号S0075)。PrimeScriptTMRT reagent Kit(产品编号RR047A)和TB Green®Premix Ex TaqTMII(产品编号RR820A)购于宝日医生物技术(北京)有限公司。CGRP ELISA Kit(美国Cusabio 公司，产品编号Q99JA0)。兔抗小鼠TRPV1抗体(产品编号PAB16889)和兔抗小鼠eIF3a抗体(产品编号ABP58469)购于武汉艾美捷科技有限公司。兔抗小鼠ERK1/2抗体(产品编号#4695)及兔抗小鼠磷酸化ERK1/2抗体(产品编号#8544)购于美国Cell Signaling Technology公司。兔抗小鼠(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(产品编号bs-10900R)、兔抗小鼠(alpha smooth muscle actin,α-SMA)抗体(产品编号bs-0189R)、小鼠抗小鼠I型胶原(collagen I)抗体(产品编号bsm-33400M)、兔抗小鼠III型胶原抗体(产品编号bs-0549R)购于北京博奥森生物技术有限公司。兔抗小鼠波形蛋白(Vimentin，产品编号EPR3776)抗体、小鼠抗小鼠E钙粘蛋白(E-Cadherin，产品编号M168)抗体、小鼠抗小鼠紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1，产品编号ab96587)购于美国Abcam公司。

1.3 肺纤维化模型的建立及分组

小鼠适应性喂养一周，随机分为对照(Control, CON)组、博莱霉素(bleomycin, BLM)组、Cap (0.5、1、2 mg/kg)剂量组及Cap(2 mg/kg)+SB-452533 (2.5 mg/kg)剂量组，每组n=12。除CON组外，其余各组按3.5 mg/kg剂量气管滴注博莱霉素制备肺纤维化模型。CON组除气管滴注等量的生理盐水外，其余造模方法与BLM组相同。Cap 各组及Cap+SB-452533组连续皮下注射给药21 d，其中Cap+SB-452533组先给予SB-452533，60 min后再给予Cap。

1.4 ELISA法检测血浆CGRP浓度

小鼠眼球摘除取血0.5 ml，放入1.5 ml离心管中(管中提前加入50 μl 10% Na2EDTA和50 μl抑肽酶)，5 000 r/min离心10 min收集血浆。按CGRP ELISA Kit说明书测定血浆CGRP的OD值，并根据标准曲线计算CGRP的浓度。

1.5 形态学分析

取小鼠左肺下叶，制成5 μm的石蜡切片。按HE染色步骤进行染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.6 肺组织胶原变化分析

取小鼠左肺下叶，制成5 μm的石蜡切片。按Masson染色步骤进行染色，胶原纤维被染成蓝色，光镜下观察肺组织胶原变化。另外，采用石蜡切片，根据SABC免疫组化法步骤检测肺组织collagen III蛋白表达，collagen III一抗浓度为1∶500，相应二抗浓度为1∶500。肺组织collagen III阳性表达呈黄至棕黄色颗粒。

1.7 基因表达分析

按PrimeScriptTMRT reagent Kit说明书提取左肺上叶总RNA并将RNA逆转录成cDNA。然后按照TB Green®Premix Ex TaqTMII试剂盒说明书，以2 μl cDNA为模板，20 μl反应体系，用StepOnePlusTMReal-Time PCR System进行qPCR扩增。PCR反应条件参照我们前期的研究结果[5]。以GAPDH为内参，统计各组ΔΔCt值，计算相应RQ值并进行分析。引物列表如下(表1)。

1.8 蛋白表达分析

低温条件下提取右肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。Western blot法检测相关蛋白表达，具体方法详见我们前期的研究结果[5]。相关蛋白一抗浓度分别为α-SMA(1∶1 000)、Vimentin(1∶ 1 000)、ZO-1(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、collagen I(1∶500)、TRPV1(1∶500)、eIF3a(1∶ 1 000)及GAPDH(1∶2 000)，相应二抗浓度(1∶ 2 000～1∶5 000)。用Image J 1.43软件进行灰度值测量并分析蛋白表达情况。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 小剂量Cap对纤维化小鼠肺组织形态学变化的影响

HE染色发现CON组肺泡结构正常，未见炎症反应，而BLM组肺组织结构明显破坏，肺泡结构消失，肺泡腔狭窄、萎缩，肺泡血管壁增厚，大量成纤维细胞增殖及细胞外基质聚集。而经小剂量Cap干预21 d后，上述病理变化明显减轻。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，小剂量Cap的作用被明显抑制(图1)。

Fig. 1 Effects of capsaicin on lung histopathological changes in lung tissues(HE staining ×200)

2.2 小剂量Cap对纤维化小鼠肺组织胶原变化的影响

改良的Masson染色结果显示CON组蓝染的胶原纤维较少，而BLM组蓝染的胶原纤维明显增多。经小剂量Cap干预21 d后，蓝染的胶原纤维明显减少。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，蓝染的胶原纤维又明显增多(图2)。同时，经qPCR、Western blot和免疫组化检测发现，BLM组collagen I 和collagen III的基因表达和蛋白表达明显上调，而经小剂量Cap干预21 d后collagen I 和collagen III的基因表达和蛋白表达明显下调。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，小剂量Cap的这些作用被明显取消。表明小剂量Cap能够改善肺纤维化肺组织的胶原沉积(表2，图3，图4)。

Fig. 2 Effects of capsaicin on collagen levels in lung tissues(Masson’s staining ×200)

Tab. 2 Effects of Cap on collagen I and collagen III expressions in lung tissues n=9)

Fig. 3 Effects of capsaicin on collagen I in lung tissues by Western blot

Fig. 4 Effects of capsaicin on collagen III in lung tissues by immunohistochemical staining (×200)

2.3 小剂量Cap对纤维化小鼠肺泡上皮细胞EMT的影响

与CON组相比，BLM组肺泡上皮细胞标志物ZO-1 和E-cadherin mRNA及蛋白表达水平明显降低而间质细胞标志物α-SMA和Vimentin mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与BLM组相比，Cap不同剂量组ZO-1 和E-cadherin mRNA及蛋白表达不同程度升高而α-SMA和Vimentin mRNA及蛋白表达不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，小剂量Cap对肺泡上皮细胞EMT的影响明显降低(表3，表4，图5)。

Tab. 3 Effect of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin and α-SMA mRNA expressions in lung tissues n=9)

Tab. 4 Effect of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin andα-SMA protein expressions in lung tissues n=9)

Fig. 5 Effects of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin and α-SMA in lung tissues by Western blot

2.4 小剂量Cap对纤维化小鼠肺组织TRPV1受体及CGRP表达的影响

与CON组相比，BLM组TRPV1表达明显下调，同时肺组织CGRP mRNA表达水平及血浆CGRP的浓度明显降低(P<0.01)。与BLM组相比，而经小剂量Cap干预21 d后，TRPV1表达明显上调，同时肺组织CGRP mRNA表达水平及血浆CGRP的浓度明显升高(P<0.05或P<0.01)。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，肺组织CGRP mRNA表达水平及血浆CGRP的浓度又明显降低(P<0.01)。表明小剂量Cap可能通过激动TRPV1受体而促进CGRP的释放而产生抗纤维化作用(图6，表5)。

Fig. 6 Effects of Cap on TRPV1 in lung tissues by Western blot

Tab. 5 Effect of Cap on TRPV1 and CGRP expressions n=9)

2.5 小剂量Cap对纤维化小鼠肺组织ERK1/2/eIF3a信号通路的影响

与CON组相比，BLM组肺组织ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与BLM组相比，Cap不同剂量组ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表达水平不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。但当使用辣椒素受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表达水平又明显升高(表6，图7)。

Tab. 6 Effects of Cap on Phospho-p44/42 and eIF3a expressions in lung tissues n=9)

Fig. 7 Effects of Cap on Phospho-p44/42 and eIF3a in lung tissues by Western blot

3 讨论

上皮间质转分化(EMT)是上皮细胞逐渐向间充质样细胞转化，丧失上皮细胞功能特性而获得间质细胞(如MFb)特性的过程，在PF的发病机制中起着重要作用[2]。在此过程中，上皮细胞失去了一些细胞标志物，如ZO-1 和E-cadherin，获得了间质细胞标志物，如α-SMA和Vimentin，最终异常的上皮细胞分化为成纤维细胞或MFb，并且产生过多的ECM并破坏肺组织结构，导致纤维化的发生[3]。大量的实验研究表明，抑制肺泡上皮细胞EMT，在一定程度上能够缓解肺纤维化的发生与发展[12]。Cap是一种脂溶性的生物碱，具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用[7]。Bitencourt[13]等人研究发现，Cap能够明显缓解胆汁淤积导致的肝纤维化。Xu[8]等人研究发现Cap能够抑制人乳头状甲状腺癌细胞EMT，进而抑制肿瘤细胞的的粘附、迁移和侵袭。而本实验结果显示，3个剂量Cap连续给药21 d后，肺泡上皮细胞EMT明显减轻(肺组织ZO-1 和E-cadherin的表达明显升高而α-SMA和Vimentin的表达明显降低)，肺组织胶原沉积明显减轻(肺组织蓝染的胶原纤维明显减少，collagen I 和collagen III的表达明显降低)，肺纤维化程度明显缓解，且Cap (2 mg/kg)剂量组的缓解作用明显高于Cap (0.5 mg/kg)剂量组和(1 mg/kg)剂量组。表明小剂量Cap能够缓解博莱霉素诱导的肺纤维化。

目前已知Cap的镇痛、抗癌、抗纤维化等作用与其激动体内受体TRPV1有关。TRPV1受体是一种非选择性的阳离子通道，广泛分布于感觉神经纤维和非神经细胞上(如内皮细胞和平滑肌细胞等)[14]。Qu等人研究发现Cap通过激动TRPV1受体，释放扩血管物质P物质而缓解野百合碱诱导的肺动脉高压[15]。Zhong等人研究发现N-油酰多巴胺通过激动TRPV1受体，促进内源性P物质和CGRP的释放而对心肌缺血/再灌注损伤具有显著的保护作用[16]。Li等人研究发现Cap是通过激活TRPV1 而产生NO、CGRP 而产生心血管保护作用[11,12]。同时研究还发现激动TRPV1受体介导的CGRP释放也参与BLM诱导的小鼠肺纤维化[17]。而大剂量Cap(50 mg/kg)连续给药3 d耗竭体内P物质和CGRP后，能够明显加重BLM诱导的肺纤维化[5]。以上结果提示CGPR参与肺纤维化的疾病过程，促进内源性CGRP的缓慢释放有望缓解肺纤维化。而研究发现，而经3个剂量Cap干预21 d后，TRPV1表达明显上调，同时肺组织及血浆CGRP的水平明显升高，且Cap (2 mg/kg)剂量组的上调作用明显高于Cap (0.5 mg/kg)剂量组和(1 mg/kg)剂量组；但当使用TRPV1受体阻断剂SB-452533阻断辣椒素受体后，CGRP的水平又明显降低，Cap抗肺纤维化作用明显减弱。表明小剂量Cap可能通过激动TRPV1受体而促进CGRP的释放而产生抗肺纤维化作用。

目前大量的研究表明TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT在肺纤维化的发病过程中起着重要作用[18]。Wang等人发现TGF-β1通过ERK1/2信号通路等介导肺泡上皮细胞EMT，但其具体的下游靶点不是很清楚[19]。我们的研究结果也显示，在博莱霉素诱导发肺纤维化肺组织中ERK1/2的磷酸化水平和eIF3a的表达明显升高，而抑制eIF3a的表达后，肺纤维化程度明显减轻[5,20]。在此基础上我们进一步发现，ERK1/2/eIF3a信号通路介导TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT，而外源性CGRP能够明显抑制ERK1/2的磷酸化，降低eIF3a的表达而抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT[6]。而本实验发现，3个剂量Cap能够分别明显降低肺组织ERK1/2的磷酸化水平、抑制eIF3a的表达，且Cap (2 mg/kg)剂量组的抑制作用明显高于Cap (0.5 mg/kg)剂量组和(1 mg/kg)剂量组；而Cap的这一作用能够被TRPV1受体阻断剂SB-452533所取消。表明小剂量Cap可能通过激动TRPV1，促进内源性CGRP的释放，抑制肺组织ERK1/2的过度磷酸化及eIF3a的表达而产生抗肺纤维化作用。

综述所述，小剂量Cap能够逆转肺泡上皮细胞EMT、缓解肺纤维化。其机制可能与其激动TRPV1、促进CGRP释放，进而抑制ERK磷酸化和下调eIF3a的表达有关。