慢性阻塞性肺疾病稳定期患者外周血CD8+T细胞自噬水平与数量的相关性分析

庄虹 卓宋明

【摘要】 目的 探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）稳定期患者外周血细胞毒性T淋巴细胞（CD8+ T细胞）自噬水平与数量的相关性。方法 120例COPD稳定期患者作为观察组， 同期120例健康体检者作为对照组， 采用流式细胞术计算CD8+ T细胞总数， 检测CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数和凋亡率;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测LC3、p62基因表达水平;采用蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达水平。比较两组CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数、CD8+细胞凋亡率， LC3、p62基因以及LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白在CD8+ T细胞中的表达;分析LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数的相关性。结果 观察组CD8+ T细胞总数（32.40±4.25）%、CD8+效应性T细胞数（25.62±8.17）%、CD8+记忆性T细胞数（22.09±6.54）%均高于对照组的（25.94±4.61）%、（16.78±5.49）%、（7.83±3.02）%， CD8+细胞凋亡率（23.52±6.10）%低于对照组的（31.36±5.03）%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。观察组p62基因、自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达均高于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;但两组LC3基因表达对比， 差异无统计学意义（P>0.05）。LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均呈正相关（P<0.05）;p62蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均呈正相关（P<0.05）。结论 COPD稳定期患者外周血CD8+ T细胞自噬水平与数量呈正相关， 提示可能通过增加CD8+ T细胞数量， 提高细胞自噬能力， 从而稳定COPD的气道慢性炎症。

【关键词】 慢性阻塞性肺疾病稳定期;外周血CD8+ T细胞;自噬水平;数量;相关性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.24.021

COPD是常见呼吸系统疾病， 也是全球死因排在第三的疾病。本病以反复发作的气道炎症和进行性加重的气流受限为主要特征， 病理检查可见气道炎症和破坏性肺气肿[1]。本病的发病机制至今尚未明确， 一般认为与有害气体或有害颗粒引起肺组织的异常炎症反应有密切关联， 发病的关键可能与自身的免疫系统调节紊乱有关。大量研究证实， COPD发生发展过程中， 由巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等多种炎性细胞共同参与， 而肺泡壁的病变程度与肺泡巨噬細胞和T细胞相关[2]。因此， 了解T淋巴细胞的作用机制十分必要。CD8+ T细胞是关键的淋巴细胞亚群， 主要浸润在气道壁、气道平滑肌和支气管黏膜上皮中。有研究显示， COPD患者肺内的LC3Ⅱ/ATG 蛋白等自噬体明显上调， 提示自噬在COPD中有重要作用[3]。本研究进一步分析COPD稳定期患者外周血CD8+ T细胞自噬水平与数量的相关性， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 将2019年5月～2020年5月本院收治的120例COPD稳定期患者作为观察组， 同期120例健康体检者作为对照组。观察组中男67例， 女53例;年龄36～78岁， 平均年龄（56.4±11.2）岁。对照组中男64例， 女56例;年龄33～79岁， 平均年龄（56.3±11.7）岁。两组一般资料对比差异无统计学意义， 具有可比性（P>0.05）。

1. 2 纳入及排除标准

1. 2. 1 纳入标准 观察组均确诊为COPD， 现处于稳定期， 每月规律在门诊随诊， 咳喘症状完全缓解>2周。

1. 2. 2 排除标准 排除急性感染、自身免疫性疾病、严重心肝肾疾病、单纯疱疹病毒感染、精神疾病等的患者。

1. 3 方法 两组均采集外周静脉血6 ml， 用流式细胞术计算出CD8+ T细胞总数， 检测CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数和凋亡率;将CD8+ T细胞总数用实时荧光定量PCR检测LC3、p62基因表达水平， 用蛋白质印迹法（Western Blot）检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达水平;分析LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数的相关性。

1. 4 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验;相关分析采用Pearson相关检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组外周血中CD8+ T细胞情况对比 观察组CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均高于对照组， CD8+细胞凋亡率低于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 两组LC3、p62基因以及LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白在CD8+ T细胞中的表达对比 观察组p62基因、自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达均高于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;但两组LC3基因表达对比， 差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2. 3 CD8+ T细胞与LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表达的相关性分析 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均呈正相关（r=0.570、0.671、0.736， P<0.05）;p62蛋白表达与CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均呈正相关（r=0.546、0.663、0.731， P<0.05）。

3 讨论

COPD的核心发病机制是慢性气道炎症， CD8+ T细胞是COPD稳定期中气道慢性炎症的主要炎症细胞， 此时的CD8+ T细胞仍处于增长状态。目前， 临床对CD8+ T细胞增多的机制尚未明确， 现主流的观点认为是由病毒感染和自身特异性抗体产生增多所致。近年来， 自噬研究显示， 自噬能促进CD8+ T效应性细胞和CD8+ T记忆性细胞的形成和存活， 从而增加CD8+ T细胞总数[4， 5]。因此， 考虑自噬与CD8+ T细胞间存在相关性。

本研究对比COPD稳定期患者和健康体检者的CD8+ T细胞以及细胞自噬水平， 分析两者相关性。结果显示：观察组CD8+ T细胞总数、CD8+效应性T细胞数、CD8+记忆性T细胞数均高于对照组， CD8+细胞凋亡率低于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。观察组p62基因、自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达均高于对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）， 证实COPD稳定期患者中CD8+ T细胞数量明显增加。在CD8+ T细胞自噬相关蛋白的检测中， LC3的基因表达在COPD稳定期患者中无明显增加， 但LC3蛋白的存在形式有所差异， LC3Ⅱ/Ⅰ的水平明显增加， LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换支持自噬产生增多， 因此， LC3Ⅱ/Ⅰ可用于评估自噬活跃程度[6]。说明在LC3基因分布相当的情况下， COPD稳定期患者的LC3Ⅱ/Ⅰ自噬水平更高[7]。p62基因、p62蛋白在COPD稳定期患者中处于升高状态。p62蛋白是细胞自噬过程中的自噬底物， 在自噬过程中起到重要的作用。自噬体LC3Ⅱ形成后， 由p62引导， 与自噬体膜连接， 形成自噬溶酶体， 最后被p62降解[8]。由于COPD穩定期时自噬活跃， 造成了p62的堆积。

综上所述， COPD稳定期患者CD8+ T细胞数量明显增加， 自噬水平明显升高， 两者呈正相关， 为临床研究COPD发病机制提供了新思路。

参考文献

[1] 陈钢， 熊先智. CD8+调节性T细胞在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展. 中国免疫学杂志， 2014， 30（11）：1567-1573.

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[3] 陈颖， 石赟， 陈燕蓉， 等. 稳定期慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴细胞活化标志物表达水平的研究. 临床和实验医学杂志， 2018， 17（5）：485-489.

[4] 张建初， 王佩， 熊先智， 等. M受体拮抗剂对提高慢性阻塞性肺疾病患者调节性T细胞表达的影响. 中华结核和呼吸杂志， 2010， 33（1）：33-36.

[5] 庄虹. 慢性阻塞性肺疾病稳定期患者外周血CD8+ T细胞自噬水平与数量的相关性研究. 遵义医学院， 2018（1）：1-57.

[6] 李世川， 张湘燕， 廖强， 等. CD8+ T细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态在慢性阻塞性肺疾病中的作用. 中华结核和呼吸杂志， 2015， 38（11）：862-864.

[7] 卓宋明， 徐文莉， 梁珊瑚， 等. 慢性阻塞性肺疾病患者T淋巴细胞亚群凋亡与Fas、Fas L、Bcl-2表达的关系. 中华临床医师杂志， 2011， 35（6）：1554-1560.

[8] 孙霞， 张志鹏， 温煦， 等. 慢性阻塞性肺病患者外周血单个核细胞自噬与疾病状态的相关性研究. 中国医师进修杂志， 2019， 42（3）：238-244.

[收稿日期：2020-06-19]