褪黑素对糖尿病大鼠非酶糖基化产物及受体表达和心脏功能变化的影响

崔刚 张东东 韩雪 孙权

(1佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2保山中医药高等专科学校)

糖尿病心肌病(DCM)由Hamby等〔1〕于1974年首次提出，是一种糖尿病患者特殊的心肌病变，由糖尿病继发而来，且独立于冠心病和高血压之外，以心肌能量代谢或结构异常改变导致心肌细胞重塑，通过影响心肌细胞重塑最终引起心脏收缩舒张功能障碍〔2〕。DCM临床发病率高，危害大，现公认为常见和严重的糖尿病慢性并发症之一，成为现今研究的热点〔3，4〕。研究表明，沉积于心血管组织，由蛋白质和残留糖发生非酶化反应生成的糖基化终末产物(AGEs)在糖尿病心肌纤维化的发生发展中极其重要〔5〕。AGEs 可与其受体(RAGE)结合并激活一系列信号转导通路进而诱导成纤维细胞增殖〔6〕。作为免疫球蛋白超蛋白的一种细胞表面分子，RAGE与其他受体存在明显不同。一般受体会受到增加的配体水平的反馈性抑制，而RAGE 则会因为配体水平的升高增加其表达〔7〕。褪黑素(MT)属于吲哚类激素，由松果体分泌，对人类的睡眠、生殖及昼夜节律等起到调节作用，对机体的神经、内分泌和免疫系统均有影响。研究证实MT对糖尿病并发症具有良好的干预作用，并已试用于糖尿病肾病的治疗〔8〕。本研究探讨MT对DCM大鼠心脏的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1模型建立和分组 80只Wistar大鼠清洁级雄性(长春亿斯实验动物技术有限责任公司)，体重200～220 g，分笼饲养于佳木斯大学动物实验中心，自由摄食和饮水，每天光照12 h。随机分为正常组、模型组、MT低剂量组和MT高剂量组，每组20只，分笼饲养。除正常组外，其余3组都给予高脂高糖饮食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔内(按50 mg/kg体重)注射1%链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。给药后72 h尾静脉采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。实验时每4 w检测血糖一次。造模后每天10∶00至14∶00 MT(浙江延年褪黑素公司)灌胃一次，MT低剂量组剂量为10 mg/kg体重，MT高剂量组剂量为20 mg/kg体重，正常组和模型组同等剂量生理盐水灌胃。持续给药16 w。

1.2血糖值测定和计算心脏指数 给药前、后，测量前禁食、水12 h，尾静脉采血，血糖仪测量血糖值。分别检测大鼠空腹血糖。大鼠血流动力学指标检测之后，每组部分大鼠沿心底大血管根部剪下心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干，精确称量心脏质量，心脏指数=心脏质量/体质量，称量后迅速将心脏放进-80℃冰箱冻存。

1.3心脏功能指标检测 10%水合氯醛0.03 ml/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，固定在大鼠用手术台上，用弯剪剪去下颌骨至锁骨范围的毛。用1 ml注射器向右颈总动脉内注射500 U/kg体重肝素，并在生理记录仪的插管内注满肝素。依次切开皮肤、筋膜，暴露气管，用玻璃分针游离右侧颈总动脉，分离注意避免伤及神经。结扎右侧颈总动脉远心端，近心端留手术线备用，用动脉夹夹闭右颈总动脉近心端，靠近远心端剪一斜口(血管不剪断)，插入生理记录仪插管，动脉夹放开一下，血管充盈，将插管向心脏方向插入1 cm，用手术线扎好(松紧适宜)，放开动脉夹，将插管螺旋插入4～5 cm，观察生理记录仪读数，舒张压为0 mmHg即插入左心室。使用生理记录仪，测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张期末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)和室内压上升达最大速率所需时间(t-dp/dt)等心功能指标。

1.4收集标本 断髓法处死实验大鼠，剪开胸骨，打开胸腔，暴露心脏。沿着心底大血管的根部剪断心脏，剖开右心耳，由左心室进针用200 ml左右生理盐水冲洗，当右心耳流出无色液体时可以停止冲洗，再用4%多聚甲醛溶液进行心脏固定，游离心脏放入10%中性甲醛溶液内浸泡后将组织制成5 μm厚石蜡切片。

1.5HE染色 ①脱蜡至水;②苏木素染色6 min，蒸馏水冲洗5 min;③1%盐酸-乙醇分化30 s，再次蒸馏水冲洗5 min;④伊红染色3 min，蒸馏水冲洗5 min;⑤脱水透明;⑥中性树胶封片;⑦显微镜下组织学观察并拍照。

1.6免疫组化染色 ①烤片30 min;②脱蜡脱水后将切片放入盛有Tris盐酸缓冲液(TBS)的抗原热修复盒中，放入微波炉中加热至煮沸，20 min后取出，自然冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，37℃，20 min;④一抗(RAGE浓度为1∶50，AGE浓度为1∶100)，4℃过夜;⑤复温至室温，PBS洗3次，各5 min;⑥试剂Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。试剂Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察，随时中断，蒸馏水洗3次，各3 min;⑧苏木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸馏水洗3次，各5 min，自来水冲洗2 h(AGE染色时，省略此步);⑨脱水透明;⑩中性树胶进行封片;图像采集分析采用BI200软件。所得的IOD数值越大，AGE与RAGE蛋白的表达越差；数值越小，AGE与RAGE蛋白的表达越好。

1.7统计学处理 使用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1精神状态 正常组状态活泼，每日进食量和饮水量稳定，体重随周龄增加而平稳增加，眼睛有神发亮，行为动作反应快速，常出现打闹现象，皮毛光滑有光泽，鼠尾色泽红润，大、小便正常。模型组状态萎靡，每日进食量和饮水量增多、过频；体重增加随周龄增加而迟缓，有的甚至出现停滞；反应速度有些迟钝，出现抱团扎堆现象，皮毛暗淡不平顺、无光泽，眼神目光呆滞，鼠尾颜色发白，小便过频、大便时干时稀不规律。MT低剂量组和MT高剂量组精神状态尚可，每日进食量和饮水量趋于正常，体重增加缓慢，随周龄增长增加缓慢；日常活动略有增加，但动作略有迟缓；皮毛略有柔顺、光泽，眼睛发灰，略显呆滞，鼠尾毛色略有光泽，大便略稀，小便趋于正常。

2.2血糖、体重和心脏指数 MT处理16 w后，与正常组比较，模型组、MT低剂量组和MT高剂量组血糖和心脏指数明显升高(P<0.05)，模型组和MT低、高剂量组体重显著降低(P<0.05);与模型组比较，MT低剂量组和MT高剂量组血糖值略降低，心脏指数略升高，但无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组空腹血糖值、体重及心脏指数

2.3心脏功能 与正常组比较，模型组心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差异具有显著性(P<0.05)；MT低、高剂量组心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差异不显著(P>0.05)；与模型组比较，MT低、高剂量组LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差异具有显著性(P<0.05)，MT低、高剂量组差异不显著(P>0.05)。见表2。

表2 各组心功能指标比较

2.4心肌HE染色结果 正常组心肌细胞体积正常，排列整齐，心肌各层均匀，结构清晰；胞质清澈，胞质颜色正常；心肌细胞核圆形或椭圆形，染色质分布均匀。模型组心肌细胞体积明显增大，排列紊乱、肿胀，心肌各层次不均，结构不清；胞质浑浊，胞质颜色变浅；细胞核呈长杆状，核固缩，核膜皱缩，出现双核，排列紊乱，染色质边聚于核膜下呈颗粒状。MT低剂量组和MT高剂量组心肌细胞体积略小，排列趋于整齐，心肌各层次结构和心肌细胞间隙略清晰可以辨认；胞质略有浑浊，颜色略浅，细胞核形态趋于正常的圆形或椭圆形，染色质均匀可见。MT低剂量组较MT高剂量组更明显(图1)。

图1 各组心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE蛋白表达 AGE蛋白棕黄色阳性表达见于心肌细胞胞质或心肌细胞间质内，RAGE蛋白棕黄色阳性表达多见于心肌细胞膜上。处理16 w后，与模型组比较，MT低剂量组和MT高剂量组AGE、RAGE蛋白表达IOD值明显升高(P<0.05)；与正常组比较，MT低剂量组和MT高剂量组AGE和RAGE蛋白表达差异不显著(P>0.05)(表3和图2)。

表3 各组心肌组织中AGE和RAGE蛋白表达

图2 各组心肌中AGE、RAGE蛋白免疫组化(×400)

3 讨 论

生理状态下，人和哺乳动物血清中MT的含量随着昼夜交替，呈节律性的波动，其分泌量表现为，夜间比白天要高出5～10倍，正常情况下，凌晨2∶00～3∶00达到分泌量最高值。研究表明，MT对糖尿病大鼠血糖的影响有两种观点：①MT可以通过改善胰岛素抵抗程度〔10〕和调控胰岛β细胞胰岛素的分泌释放〔11，12〕，影响机体胰岛素的代谢，并能促进细胞对葡萄糖的利用，从而影响机体的血糖代谢，直接降低糖尿病大鼠血清中的血糖水平；②也有报道〔13〕显示MT对血糖水平没有影响，研究者认为这可能由实验过程中给药时间、给药方式和给药剂量不同等所致。

随着糖尿病进展，高血糖可导致心脏胶原沉积诱发心肌间质纤维化，还可提高AGEs含量，提高心肌硬度〔14〕。研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠8～12 w心肌细胞超微结构发生改变，6～14 w发生心功能下降〔15〕。本实验提示糖尿病大鼠心肌形态改变、收缩和舒张功能下降。而使用MT进行处理的糖尿病大鼠心肌形态得到明显改善，心功能各项指标也得到了很好的控制。

在糖尿病的微血管并发症中，RAGE信号通路扮演着重要角色〔16〕。AGE广泛存在于机体的血液及各种组织、细胞中，AGE作用广泛，通过两种途径发挥其生物学效应：①直接途径，直接修饰改变蛋白质、脂质和核酸等的空间结构和功能，造成机体损伤；②间接途径，AGE与特异性受体RAGE结合后，导致机体发生病理性改变，可激活多个细胞内信号转导通路，可诱导生成氧自由基及灭活一氧化氮(NO)等，参与不同类型细胞的氧化应激反应、炎性反应和血栓形成的过程〔17〕。高血糖状态下，蛋白质发生糖基化后，氧自由基生成也随之增加，并促进AGE形成，从而导致恶性循环〔16〕。AGE生成具有不可逆性，即使纠正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在组织中继续不断地累积。因此，AGE在DM并发症发生和发展全过程中起到重要作用。

RAGE广泛存在于人体各类细胞中，属于多配体受体，不仅参与内体炎症反应，还与糖尿病慢性并发症的发生、发展有关。RAGE与AGE结合后，激活相关信号反应，使内质网膜电位去极化和减少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，导致细胞功能障碍。糖尿病可以引起心房重构，扰乱心房内传导系统，是房颤的危险因素之一。AGE与RAGE的结合与DCM发生密切相关，阻断两者的结合可能会成为预防和治疗DCM的新靶点〔18，19〕。综上，MT可抑制糖尿病大鼠AGE和RAGE蛋白间的相互影响，从而减轻DCM时的心肌损伤程度，延缓病程。

致谢：黑龙江省北药与功能食品优势特色学科建设项目的支持。