不同教槽料对断奶仔猪肠道黏膜免疫相关基因表达的影响

冯宝宝，赵 莹，马晓宇，宁丽丽，赵国琦，霍永久

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009； 2.上海新邦生物科技有限公司，上海 200000)

断奶是生猪养殖过程中的必经阶段。现代化养殖场为提高母猪利用率，增强仔猪的生产性能，普遍采用仔猪早期断奶技术。仔猪早期断奶，饲料液固转变应激较大，易破坏肠组织免疫屏障功能，并且早期断奶时仔猪主动免疫机能尚未发育完全，又受断奶应激影响更加降低了自身抗体水平，致使仔猪对病原菌的抵抗力下降，进而导致腹泻发生[1]。生产中抗生素可有效减缓断奶应激的危害，但抗生素的过渡使用会产生耐药性和药物残留等系列问题。有研究发现，仔猪机体的免疫水平与饲粮营养组成有着密切的联系，合理的饲粮组成是仔猪健康高产的关键[2]。因此，通过优化饲料结构来减缓仔猪断奶应激综合征的发生是有效方法。

教槽料中蛋白源的优劣，直接影响断奶仔猪的健康水平。豆粕在断奶仔猪日粮中应用较广，但豆粕中含有多种抗营养因子[3]，对仔猪成长十分不利。豆粕经发酵酶解后，可有效降低抗营养因子含量[4-5],并且将大分子蛋白降解为低分子蛋白和小肽，有利于仔猪吸收[6]。酵母提取物和小麦水解蛋白作为优质的饲料蛋白原料，在日粮中适量添加可为断奶仔猪补必需氨基酸、核苷酸和谷氨酰胺，促进仔猪小肠上皮细胞的增殖、分化，增强肠道正常的生理功能[7-11]。有研究显示，用19.51%的发酵酶解豆粕替换日粮中的普通豆粕饲喂仔猪，其平均日增质量、血清蛋白浓度、白球比分别提高了14.51%、18.73%和11.11%，料重比和腹泻率分别降低了9.50%和29.10%[12]。断奶仔猪日粮中添加酵母提取物和小麦水解蛋白等饲料蛋白原料，可显著改善断奶仔猪肠道和免疫器官的发育，提高机体免疫机能，降低腹泻率[13-15]。

生产中许多饲料添加剂具有肠道调节功能，在断奶仔猪日粮中使用可显著提高机体免疫机能、调节肠道菌群。益生菌作为机体有益活性菌，可通过抑制肠道病原菌的生长，调节肠道固有菌群的活性，保护机体免受断奶应激的危害[16]。植物精油作为饲料添加剂，具有广泛的抑菌、抗氧化、抗炎作用，是目前最有潜力代替抗生素的天然无害物[17]。宋转等[18]研究发现,在仔猪日粮中添加50 mg/kg的复合植物精油能够有效缓解仔猪氧化应激导致的肠道损伤。蒋志等[19]研究表明，饲料中添加0.08%的包被精油复合酸有增强断奶仔猪免疫力的趋势。饲粮中优质蛋白源的选择和肠道保护剂的添加对断奶仔猪肠道健康起着重要的作用，目前仔猪日粮中添加的蛋白源、微生态制剂、植物精油、酸化剂等组合单一，而将它们全面配比组合后对仔猪肠道黏膜免疫屏障机能影响的研究较少。为此，在仔猪日粮中添加优质蛋白原料，且将益生菌、植物精油、酸化剂等配比混合添加到饲粮中，研究它们共同作用对断奶仔猪肠道黏膜炎症因子和紧密连接蛋白基因表达量的影响，以期为无抗生素时代仔猪的健康高效生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

发酵酶解豆粕、酵母提取物、小麦水解蛋白粉、肠道保护包均由上海新邦生物科技有限公司提供。肠道保护包成分为复合酸化剂、植物精油和复合益生菌组合。复合酸化剂：总酸(以乳酸计)含量≥70%，其中乳酸≥35%，柠檬酸≥28%，富马酸≥2%；植物精油：肉桂醛15%～25%，百里香酚3%～5%，香芹酚3%～5%，丁香酚3%～5%，其余为载体二氧化硅，明胶，变性淀粉，硬脂酸；复合益生菌：有效活菌含量≥1×1010cfu/g，乳酸菌活菌数≥1×109cfu/g，枯草芽孢杆菌活菌数≥1×109cfu/g，酵母菌活菌数≥1×109cfu/g)。

1.2 试验设计

本试验选取90头21日龄体质量[(6.85±0.25)kg]相近的杜洛克×长白×大约克断奶仔猪，随机分为3组，每组3个重复，每个重复10头猪。对照组(CON组)饲喂基础饲粮；优质蛋白源组(HP组)：基础饲粮中添加优质蛋白原料(基础饲粮中的豆粕蛋白原料被发酵酶解豆粕、酵母提取物和小麦水解蛋白粉所代替)；优质蛋白源+肠道保护包组(HPP组)：基础饲粮中添加优质蛋白原料和肠道保护包，预饲7 d，试验期共14 d。

1.3 基础饲粮与饲养管理

基础饲粮参照NRC(2012)营养需要配置的粉状配合饲料，原料组成及营养水平见表1。试验猪自由采食和饮水，防疫消毒均按猪场管理规程进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.4 试验方法

在仔猪断奶0、3、7、14 d，仔猪空腹12 h，每组随机抽取3头试验猪屠宰，分离肠道，刮取十二指肠、空肠、回肠、结肠黏膜，在液氮中保存。使用天根组织RNA提取试剂盒提取空肠、回肠、结肠黏膜冻存样RNA。使用One Drop紫外超微量分光光度仪测定RNA的浓度和纯度。使用的Takara反转录试剂盒将样品总RNA反转录成cDNA，所有操作均在冰上进行，反转录体系为10 μL：总RNA为500 ng、5×Prime Script RT Master Mix 2 μL，无RNA酶水补足到10 μL。反应条件：37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s，cDNA在-20 ℃冰箱待测。通过NCBI PubMed软件设计IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10、ZO-1、Occludin、Claudin-1基因的特异性引物，用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测，引物序列见表2。PCR反应体系为20 μL：cDNA模板100 ng、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、灭菌蒸馏水补足20 μL体系。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，每个样品3个重复。使用GAPDH作为内参，采用△△CT法检测实时定量PCR中各基因表达的相对差异；△△CT=(CT目的基因-CTGAPDH)处理组-(CT目的基因-CTGAPDH)对照组，计算2-△△CT得到目的基因在各组中的相对表达水平。

表2 qRT-PCR中基因引物序列Tab.2 Sequences of gene primers for qRT-PCR

1.5 数据处理与统计分析

数据经Excel 2013进行初步整理，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同教槽料对断奶0、3、7、14 d仔猪肠道黏膜TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10基因表达的影响

2.1.1 仔猪断奶0 d 由图1可知，仔猪断奶0 d时，十二指肠中HPP组TGF-β的基因表达量显著高于CON组和HP组(P<0.05)；空肠、回肠、结肠TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表达量没有显著差异(P>0.05)。

不同字母表示不同组别间存在显著差异(P<0.05)，下同

2.1.2 仔猪断奶3 d 由图2可知，仔猪断奶3 d时，十二指肠中HP组和HPP组IL-1β的基因表达量均高于CON组(P<0.05)；回肠中HP组和HPP组IL-1β的基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；结肠中，HP组和HPP组TNF-α、TGF-β、IL-10的基因表达量均高于CON组，且达到了显著水平(P<0.05)。

2.1.3 仔猪断奶7 d 由图3可知，仔猪断奶7 d时，空肠中HP组和HPP组TNF-α和IL-10的基因表达量显著高于CON组(P<0.05)；回肠中HP组和HPP组TNF-α和IL-10的基因表达量显著高于CON组(P<0.05)，HP组IL-1β、TGF-β的基因表达量显著高于CON组；结肠中HP组和HPP组IL-1β和IL-10的基因表达量均高于CON组(P>0.05)。

图2 不同教槽料对断奶3 d仔猪十二指肠(A)、空肠(B)、回肠(C)、结肠(D)黏膜

图3 不同教槽料对断奶7 d仔猪十二指肠(A)、空肠(B)、回肠(C)、结肠(D)黏膜

2.1.4 仔猪断奶14 d 由图4可知，仔猪断奶14 d时，空肠中HP组和HPP组TNF-α、IL-1β基因表达量均显著高于CON组(P<0.05)，HPP组TGF-β基因表达量显著高于CON组和HP组(P<0.05)，HPP组IL-10基因表达量高于CON组(P<0.05)；回肠中HP组和HPP组TGF-β基因表达量均显著高于CON组(P<0.05)；十二指肠和结肠黏膜各组间TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表达量无显著差异(P>0.05)。

图4 不同教槽料对断奶14 d仔猪十二指肠(A)、空肠(B)、回肠(C)、结肠(D)黏膜

2.2 不同教槽料对断奶0、3、7、14 d仔猪肠道黏膜屏障功能相关基因Occludin、Claudin-1、ZO-1表达量的影响

2.2.1 仔猪断奶0 d 由图5可知，仔猪断奶0 d时，回肠中HP组和HPP组Occludin、ZO-1的基因表达量均高于CON组(P>0.05)。结肠中HP组和HPP组Claudin-1的基因表达量显著高于CON组(P<0.05)。

2.2.2 仔猪断奶3 d 由图6可知，仔猪断奶3 d时,回肠和结肠中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量相比于断奶0 d均有所上升。回肠中HP组和HPP组Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量均高于CON组(P<0.05)。结肠中HP组和HPP组Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量显著高于CON组(P<0.05)。

2.2.3 仔猪断奶7 d 由图7可知，仔猪断奶7 d时，回肠HP组和HPP组Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量显著高于CON组(P<0.05)，且HP组表达量最高。结肠中各组间Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量无显著差异(P>0.05)。

2.2.4 仔猪断奶14 d 由图8可知，仔猪断奶14 d时，回肠中HP组和HPP组ZO-1的基因表达量高于CON组(P>0.05)。结肠中HPP组Occludin和Claudin-1的基因表达量均高于CON组和HP组(P>0.05)，HP组ZO-1的基因表达量高于其他两组(P>0.05)。

图5 不同教槽料对断奶0 d仔猪回肠(A)、结肠(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相对表达量的影响Fig.5 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 0 day weaned piglets

图6 不同教槽料对断奶3 d仔猪回肠(A)、结肠(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相对表达量的影响Fig.6 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 3 days weaned piglets

图7 不同教槽料对断奶7 d仔猪回肠(A)、结肠(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相对表达量的影响Fig.7 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes in ileum(A) and colon(B) mucosa of 7 days Weaned Piglets

图8 不同教槽料对断奶14 d仔猪回肠(A)、结肠(B)黏膜Occludin、Claudin-1、ZO-1基因相对表达量的影响Fig.8 Effects of different creep diet on the relative expression levels of Occludin,Claudin-1 and ZO-1 genes inileum(A) and colon(B) mucosa of 14 days weaned piglets

3 结论与讨论

3.1 不同教槽料对断奶仔猪肠道黏膜细胞因子相关基因表达的影响

动物体中的细胞因子是一类胞外蛋白或糖蛋白，具有来源范围广、功能多等特点，能够激发动物免疫系统的修复功能，参与细胞凋亡、修复、增殖和分化等。机体中具有传递抗原信息、诱导促进其他淋巴细胞活性的T淋巴细胞称为辅助性T细胞(Th)，根据不同功能将辅助性T细胞分为Th1和Th2细胞[20]，肠道Th1细胞因子有IL-1β、TNF-α、IFN-γ等促炎因子，Th2细胞因子有IL-4、IL-10等抗炎因子，机体在正常状态下Th1/Th2型免疫应答系统保持着动态平衡的关系[21]。TGF-β是由激活的淋巴细胞产生，具有控制免疫细胞增殖、分化和活化，降低体内炎症反应发生的作用。

仔猪断奶后，由于断奶应激，机体中与炎症相关的信号通路如NF-κB等被激活，引发炎性细胞浸润，导致机体炎症的发生[22-23]。本试验中仔猪断奶0 d时，各组间空肠、回肠、结肠黏膜细胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表达量无显著差异，而在断奶3 d和7 d时，受断奶应激的影响，机体已激活自身免疫系统，导致十二指肠、空肠、回肠、结肠中TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表达量均上调，其中以HP组和HPP组上调最明显，直至断奶14 d时，空肠中细胞因子的表达量仍是显著高于对照组的。HP组和HPP组仔猪肠道黏膜促炎因子、抗炎因子基因水平相比于CON组均有所提高，以HPP组提高最为明显。PIE等[24]发现，仔猪在断奶后肠道黏膜受到采食转变的应激会发生短暂的炎症反应，在断奶14 d内会上调肠黏膜促炎因子IL-1β和IL-6的基因表达量。原伟伟等[25]研究发现，断奶仔猪日粮中添加谷氨酰胺、小麦水解蛋白可显著提高仔猪血清中IL-1β的含量，但IL-6和TNF-α的变化不是很显著，表明谷氨酰胺和小麦水解蛋白可以刺激细胞因子的分泌。刘虎传等[26]研究发现，在仔猪日粮中添加益生菌，可显著提高血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量，表明仔猪日粮中添加益生菌能够刺激机体细胞因子的分泌，本试验结果与前人研究结果较为一致。本试验中，虽然HP组和HPP组肠道促炎因子TNF-α、IL-1β的基因表达量有所提高，但同时TGF-β、IL-10的基因表达量也是升高的，并没有打破Th1/Th2的动态平衡。HP组和HPP组肠道黏膜中较高的细胞因子表达量说明这两组断奶仔猪机体的免疫机能增强，证明教槽料中使用优质蛋白源和肠道保护包能增强仔猪免疫器官的发育，增加免疫细胞数量，提高肠道黏膜免疫屏障的功能。

3.2 不同教槽料对断奶仔猪肠道黏膜屏障功能相关基因表达的影响

肠道黏膜的紧密连接蛋白结构是机体防御病原菌进入的重要屏障，它是肠黏膜细胞间的重要连接方式[27]。Claudin、Occludin和ZO-1是决定肠黏膜完整性和通透性的重要分子[28]。紧密连接蛋白之间结合形成紧密连接蛋白复合物并与细胞骨架相连，维持细胞间的紧密连接，发挥细胞屏障功能。有研究者发现，用轮状病毒对断奶仔猪进行攻毒，18 d后检测到回肠黏膜中ZO-1和Occludin的基因表达量均显著降低[29]。YAN等[30]发现，大肠杆菌K88感染的仔猪肠道ZO-1的表达量显著降低。由此可以得出，当动物在受到病毒和细菌感染时，其紧密连接蛋白的表达量便会降低。本试验中仔猪断奶3 d时，HP组和HPP组仔猪的回肠和结肠中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量显著高于对照组，并且在断奶7 d时，回肠中Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量仍处在较高水平。断奶后3～7 d是断奶应激的主要阶段，而此时HP组和HPP组显著上调了肠道紧密连接蛋白相关基因的表达量，说明HP组和HPP组饲喂的教槽料可积极应对断奶应激导致的大肠杆菌和病毒感染，使仔猪在断奶阶段可以平稳过渡。

综上所述，教槽料中使用优质蛋白源和肠道保护包可上调肠道黏膜细胞因子相关基因的表达量，提高机体免疫机能。HP组和HPP组饲喂的教槽料还可增强仔猪肠黏膜中紧密连接蛋白相关基因的表达量，增强仔猪肠道的屏障功能，降低病原菌入侵仔猪肠道的风险。