蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

冯小娜,齐 娜,宋 伟,刘 佳,刘立明,吴 静,*

(1.江南大学药学院,江苏无锡 214122;2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)是唯一一种能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂,对细胞代谢过程有重要的调节作用[1-2],广泛应用于治疗脑萎缩、儿童多动症、老年痴呆症[3-4]、修复大脑损伤[5]、恢复脑疲劳、缓解抑郁[6-7]。由于自然界中天然PS含量稀少[8-9],且提取工艺繁杂,难以满足人们日益增长的需求,因此,开发环境友好、安全性高的磷脂酰丝氨酸生产方法,对进一步扩大磷脂酰丝氨酸应用范围、改善人民身体健康具有重要意义。

PS的制备方法分为提取法和生物酶法[10-11]。提取法是以动物肝脏、脑或大豆等植物种子为原料,通过使用大量有机溶剂萃取制得,成本昂贵且工艺复杂,难以大规模工业化生产[12]。生物酶法以磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)和L-丝氨酸(L-serine)作为反应底物,在磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)或磷脂酰丝氨酸合酶(Phosphatidylserine synthase,PSS)的催化作用下,发生转磷脂酰基反应生成PS[13]。这一技术路线具有反应条件温和、操作步骤简单、环境污染小、产品安全性高等优点[14]。

磷脂酶(Phospholipase D,EC 3.1.4.4,PLD)广泛分布于动物肝脏、植物根叶和微生物中[15]。PLD既能发生水解反应,水解磷脂生成磷脂酸,也能发生转磷脂酰反应,催化羟基化合物(L-serine、甘油、乙醇胺、肌醇)结合到磷脂酰基上,形成新的磷脂[16]。其中转磷脂酰作用更加重要,可以合成稀有磷脂如PS等[17]。然而,野生型PLD的转磷脂酰活性较低,造成产品转化效率不高,难以满足工业化应用的需求。对酶分子进行蛋白质功能改造能有效提高催化活性、扩大底物范围和改善酶稳定性[18],但有关蛋白质工程改造PLD提高PS产量的研究较少。Ogino等[19]证明轮枝链霉菌PLD中的保守甘氨酸-甘氨酸(GG)和甘氨酸-丝氨酸(GS)基序,特别是丝氨酸残基对转磷脂酰化活性至关重要,突变体G215S、G216S和G216S/S489G的转磷脂酰化活性增强9～27倍。

针对这一现状,本文将不同来源磷脂酶D在大肠杆菌中在进行异源表达,筛选出最佳来源的PLD并进行同源建模,基于结构分析催化通道及活性口袋,对其进行蛋白质工程改造,从而获得磷脂酰丝氨酸(PS)产量提高的突变体,进一步对产量提高的机制进行阐释,并将最佳突变体在3 L规模转化体系中进行应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷脂酶D目的基因来源菌株:StreptomycesghanaensisCGMCC 4.1967、StreptomyceskatraeCGMCC 4.1914、StreptomycesmobaraensisCGMCC 4.1719、AcinetobacterradioresistensCGMCC 1.15256、AcinetobactervenetianusACCC 19918、ThalassomonasactiniarumCGMCC 1.12876、StreptomycesgriseofuscusACCC 41181 购买自中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC/中国农业微生物菌种保藏中心ACCC;E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)、载体pET-28a质粒 均由作者所在实验室保藏;Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker、Solution I、DpnI Takara公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)股份公司;SanPrep柱式PCR产物胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素 生工生物工程(上海)股份有限公司;标品磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸 美国Sigma-Aldrich公司;胰蛋白胨、酵母粉 英国OXIOD公司;其他试剂 均为国产分析纯,购自上海国药集团化学试剂有限公司。

ZQZY-CS9摇床 上海知楚仪器公司;VS-1300L超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;164-5050核酸电泳仪 美国Bio·Rad公司;320-S型台式精密pH计 瑞士METTLER公司;Agilent 1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;SpetraMax M3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司;UV-2450型紫外-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PLD的异源表达及重组菌株的发酵培养 提取7种不同来源菌株(Streptomycesghanaensi、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensi、Acinetobacterradioresistens、Acinetobactervenetianus、Thalassomonasactiniarum、Streptomycesgriseofuscus)的基因组DNA,以其为模板,利用PCR扩增得到PLD的目的基因。将以上片段与T载连接并导入E.coliJM109(DE3)中,提取质粒后与pET-28a(+)的质粒均进行双酶切,酶切产物连接后导入E.coliBL21(DE3)中。

将以上7种大肠杆菌重组菌株接种于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养12 h,按照2%的接种体积分数转接于100 mL含卡那霉素抗性的TB培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养至OD600为0.6～0.8时,添加IPTG至其终浓度为1.0 mmol/L,25 ℃诱导培养12 h。4 ℃、6000 r/min条件下离心获得的菌体即为全细胞催化剂,按照1.2.2和1.2.8方法测定7种重组菌株对底物磷脂酰胆碱的转化能力及酶活。

1.2.2 两相体系转化PC和L-serine 以野生型PLD作为全细胞催化剂,使用双相体系制备PS。有机相使用绿色溶剂环戊基甲醚、水相、有机相的体积比为1∶3、L-serine和PC的底物摩尔比为5∶1,其中底物PC的添加量为76 g·L-1，反应温度为40 ℃，转化时间为4 h。转化反应得到的磷脂产品利用高效液相色谱法(HPLC)进行检测,具体见方法1.2.9。

1.2.3 磷脂酶D的同源建模及分子对接 利用SWISS-MODEL在线网站(https://swissmodel. expasy. org/)搜索与Streptomyceskatrae菌株磷脂酶D的蛋白序列一致性较高的蛋白晶体结构,运用MODELLER9.11(http://salilab.org/modeller)程序对该蛋白晶体进行同源建模,并采用蛋白分子可视化软件PyMol(http://pymol.org)对模拟的磷脂酶D蛋白三级结构进行分析。

使用ChemSpider在线网站(http://www. chemspider. com/)下载配体PC、L-serine和H2O的3D结构,并利用分子对接软件Auto Dock进行刚性对接。将配体L-serine和PC对接入复合物PLD-PC、PLD-L-serine,获得PLD-PC-L-serine、PLD-L-serine-PC两种对接结果,将配体H2O对接入复合物PLD-L-serine获得第三种对接结果PLD-L-serine-H2O。

1.2.4 PLD催化通道及催化腔体积模拟分析 利用Caver Analyst软件对SkPLD的催化通道进行模拟分析[20],软件参数设置为probe_radius 0.7、shell_depth 4.0、shell_radius 6.0;计算催化腔体积的参数设置为Pockets Large probe 4.0、Residues included His 192、His492。

1.2.5 突变体菌株的构建 将位点Asp214、Thr362、Gly398、Val400、Ser402、Tyr405突变成Ala、位点Asn209、Asp224、Gln357、Asp370、Gln405、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481依次突变成Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met。以重组质粒pET28a-SkPLD为模板进行全质粒PCR。反应体系包括PrimerStar酶0.5 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、10×PS buffer 10 μL、dNTP 4 μL、DMSO 5 μL,加水至终体积50 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min 40 s(29个循环);72 ℃延伸5 min。PCR产物经DpnI消化后转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,涂布于含卡那霉素的LB平板上。挑取阳性克隆子送至测序,测序正确的即为构建的突变体菌株。

1.2.6 突变体的动力学研究 按照1.2.2的最佳转化条件,将磷脂酶D与底物磷脂酰胆碱(PC)反应,测定PLD酶活,根据米氏方程,使用Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出磷脂酶D的动力学参数。

1.2.7 规模化制备PS 将磷脂酰丝氨酸的制备规模放大到3 L的发酵罐上进行,转化体系设置为:76 g·L-1的PC、30 g·L-1的湿菌体。控制条件为:pH5.5、温度25 ℃、通气1 vvm、搅拌转速500 r/min。

1.2.8 酶活测定方法 磷脂酶D的酶活性测定参见文献,并略作修改[21]。取13.5 μL的10 mmol/L的卵磷脂底物溶液和3.5 μL的100 mmol/L CaCl2溶液,用HCl调节pH至8.0,加入10 mL酶溶液,于50 ℃反应10 min。100 ℃反应1 min后,立即加入1 U胆碱氧化酶、1 U辣根过氧化物酶、70 μL显色液(0.24 mg/mL 4-氨基安替比林、0.16 mg/mL苯酚溶于100 mmol/L Tris-HCl),于37 ℃下反应10 min。在500 nm下检测反应液的吸光度。

酶活力定义为:以卵磷脂为底物,37 ℃条件下,每分钟产生1 μmol胆碱所需的酶量定义为一个酶活力单位,记为U/mL。

1.2.9 HPLC法检测磷脂 HPLC色谱条件:色谱柱为LiChrospher® 100 DIOL(5 μm,250 mm×4 mm),以正己烷∶异丙醇∶乙酸-乙酸钠(8∶8∶1,v/v/v)为流动相,样品用0.22 μm膜过滤,柱温为30 ℃,紫外检测波长为210 nm,进样量为20 μL,流速为1 mL/min,利用色谱图中峰面积和标准曲线,计算样品中磷脂酰胆碱PC、磷脂酰丝氨酸PS和磷脂酸PA的转化率[22]。转化率计算如下:

式中:mPS/PA表示PS、PA的质量,g;mPC表示PC的初始质量,g;742、398和758分别表示PS、PA和PC的相对分子质量。

1.3 数据处理

所有试验均重复三次。利用Original 2016软件进行数据作图分析。利用可视化软件PyMol对模拟的磷脂酶D蛋白三级结构进行作图分析。

2 结果与讨论

2.1 亲本酶及反应瓶颈

首先以Streptomycessp. PMF的PLD序列在NCBI上进行BLAST比对,选择相似性在30%～70%的7种来源不同的PLD,将其异源表达于E.coliBL21(DE3)中,具体见方法1.2.1。将7种重组菌株以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,筛选到4种具有转磷脂酰活性的PLD,分别是来源于Streptomycesghanaensis、Streptomyceskatrae、Streptomycesmobaraensis、Acinetobacterradioresistens,结果列于表1。其中Streptomyceskatrae来源的PLD酶活为18.6 U/mL、转化率为31.3%。因此,后续研究中选择Streptomyceskatrae的PLD作为亲本酶用于蛋白质改造。

表1 不同来源PLD的酶活性和转化率

为了确定提高PLD催化效率的限制因素,按照1.2.2的转化条件,以野生型SkPLD作为全细胞催化剂,使用双相体系制备PS。野生型SkPLD转磷脂酰反应的转化率为34.8%,PS产量为26.5 g·L-1;水解反应的转化率为31.2%,生成大量的副产物磷脂酸(PA),且仍有33.9%的底物PC未反应。因此,确定磷脂酶D的反应瓶颈主要包括两个方面:转磷脂酰反应的催化效率低(<35%);水解反应转化率过高(>30%),形成大量副产物PA。

2.2 磷脂酶D的蛋白质改造

2.2.1 磷脂酶D的同源建模及分子对接 为了更准确地识别影响PLD结合大体积磷脂底物的关键残基,利用Swiss-Model在线软件,选择与SkPLD蛋白序列相似性为53%的来源于Streptomycessp. PMF的磷脂酶D蛋白晶体结构(PDB编号:1F01)进行同源建模,野生型磷脂酶D结构如图1a。“HxKxxxxD(HKD)”结构域是PLD超家族的结构特征,以单拷贝或双拷贝的形式存在于一级结构中,且HKD结构域中的组氨酸残基在催化中发挥重要作用。SkPLD具有两个HKD结构域,关键催化残基为192位His和462位His。

图1 SkPLD的同源建模及分子对接

研究表明双底物(PC和L-serine)和PLD的结合顺序对于构建准确的反应模型有重要作用[23],其中PC与PLD-Ser的相互作用是唯一的结合途径。将底物PC对接入PLD-Ser复合物的活性口袋中,如图1b所示,底物磷脂酰胆碱的两条长脂肪酸链暴露在蛋白表面,这一结果表明,由于底物通道狭小或存在位阻效应,导致底物结合腔无法完全容纳体积较大的磷脂底物PC。

磷脂酶D催化合成PS的机理是[24]:His192作为亲核试剂攻击底物PC的磷原子,形成带负电荷的五价磷过渡态;然后,His462释放一个质子,提供氢以产生胆碱和磷脂酰基-酶中间体;接着,第二底物L-serine进行去质子化(脱去氢),活化的L-serine作为攻击磷脂酰基-酶中间体中磷原子的第二亲核体,从而产生磷脂酰丝氨酸(PS)。根据催化机理分析比较His462与底物L-serine和H2O的催化距离,如图1c所示,His462 N原子与L-serine O原子的催化距离d1为5.8 Å、His462 N原子与H2O O原子的催化距离d2为4.1 Å,d1>d2,且相较于L-serine,PLD与H2O的结合能(-5.19 kcal/mol)更高,说明PLD更易与水分子结合,从而发生水解反应。

因此,如要提高SkPLD的催化效率,需要从两个方向对PLD进行改造:扩大底物催化通道,降低底物进入口袋的位阻效应,使其能够容纳大体积底物PC,提高PLD的转磷脂酰活性;提高PLD活性位点His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。

2.2.2 磷脂酶D的蛋白质改造 按照方法1.2.4利用Caver Analyst软件对SkPLD的催化通道进行模拟分析,发现SkPLD有3个催化通道,分别为Tun_a、Tun_b、Tun_c,如图2a～c所示,其中Tun_a的通道长度为13.55 Å,无瓶颈半径及瓶颈氨基酸残基;Tun_b的通道长度为18.96 Å,瓶颈半径为2.03 Å,瓶颈氨基酸残基是Thr362、Gly398、Val400;Tun_c的通道长度为16.56 Å,瓶颈半径为1.83 Å,瓶颈氨基酸残基是Asp214、Ser402、Tyr405。因为瓶颈半径大小会直接影响底物分子进入活性腔的难易程度,半径越大,底物分子越容易进入活性腔[25]。因此通过引入小体积氨基酸Ala来扩大瓶颈半径,共构建6个单突变体(T362A、G398A、V400A、D214A、S402A、Y405A)进行转化,发现单突变体SkPLDY405A的突变效果最佳,转化率达到47.2%,PS产量为35.9 g·L-1。

由于底物PC的磷脂头部为亲水性,而尾部的长脂肪酸链为疏水性,磷脂酶D结合区域的亲疏水性会对底物进入活性口袋造成位阻效应。利用LigPlot+软件分析底物PC在酶催化口袋的氢键相互作用及疏水作用,如图2d所示,发现配体PC的脂肪酸链与Asn209、Asp224、Gln357、Gln405、Asn479、Tyr481发生氢键相互作用。通过引入疏水性氨基酸(Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met),构建了42个单突变体,其中单突变体SkPLDQ407G转化效果最佳,其转化率达到45.1%,PS产量为34.3 g·L-1。

图2 SkPLD的催化通道及配体PC周围的相互作用

为了提高PLD与L-serine的结合程度,将配体H2O对接入磷脂酶D的活性口袋,选择5 Å范围内的5个极性氨基酸残基(Asp370、Lys474、Lys478、Asn479、Tyr481),通过引入疏水性氨基酸来降低PLD与H2O的氢键相互作用,构建35个单突变体。其中获得两个有益单突变体SkPLDD370P和SkPLDK478P,PS转化率分别为41.7%、42.2%,PS产量分别为31.7、32.1 g·L-1。对其进行组合突变后构建双突变体SkPLDD370P/K478P,其PS转化率提高到50.8%,PS产量为38.6 g·L-1。

表2 WT及各突变体的PS、PA产量及PC残留量

将Y405A、Q407G、D370P、K478P四个有益突变位点进行组合突变,获得最佳四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,其PS转化率达到55.6%,PS产量42.3 g·L-1,分别比WT提高59.8%、59.6%。测定WT与突变体SkPLDY405A、SkPLDQ407G、SkPLDD370P、SkPLDK478P、SkPLDD370P/K478P、SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PA生成量及PC残留量,WT的PC残留量为25.8 g·L-1、PA生成量为23.7 g·L-1,四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的PC残留量为15.4 g·L-1,相较于WT降低40.3%,副产物PA生成量为18.3 g·L-1,相较于WT降低22.8%。

2.3 突变体评价及机理解析

以磷脂酰胆碱为底物测定磷脂酶D野生型及其突变体的动力学参数,结果见表3。野生型SkPLD和四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的Km值分别为12.36和10.95 mmol/L,kcat分别为9.76和16.75 s-1。四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的kcat/Km[1.53(mmol/L)-1s-1]比WT[0.79(mmol/L)-1s-1]提高93.7%,总转换数(TTN)(20100)是WT(12000)的1.68倍。

表3 WT及突变体的动力学参数

为了解析催化效率提高的原因,利用CAVER Analyst对最佳四突变体的催化腔体积进行测定。如图3a所示,WT催化腔体积为546.6 Å3,四突变体SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P的催化腔体积扩大到718.6 Å3,这一结果表明将位于底物通道的Y405、Q407突变成小体积的氨基酸Ala、Gly能显著扩大磷脂酶D催化口袋,从而提高PLD对大体积底物PC的催化活性。另一方面,四突变体SkPLDD370PY405A/Q407G/K478PHis462 N原子与L-serine O原子之间的距离(d1)比WT缩短了0.6 Å,与H2O的O原子之间的距离(d2)增加了0.8 Å,如图3c所示。此外,相较于WT,SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P与H2O的结合能减小到5.02 kcal/mol、与L-serine的结合能提高到-4.76 kcal/mol,说明位于活性位点His462附近的D370、K478突变成疏水性氨基酸Pro能够提高PLD与L-sreine的结合力。

图3 D370P、Y405A、Q407G、K478P的空间分布及催化腔变化

2.4 制备级规模转化

在最佳的转化反应条件下,将制备PS的规模放大到3 L体系进行转化。以SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P作为全细胞催化剂,反应4 h后,PS产量为50.4 g·L-1,转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h,为工业化生产磷脂酰丝氨酸奠定了基础。

图4 3L发酵罐上SkPLDD370P/Y405A/Q407G/K478P发酵产PS的过程曲线

3 结论

本研究将来源于Streptomyceskatrae的PLD过量表达于E.coli中并构建了高效催化合成PS的菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-SkPLD,限制其转化生产PS产量进一步提高的瓶颈在于:较低的转磷脂酰反应的催化效率和较高的水解反应速率。在对SkPLD蛋白结构进行详尽解析后借助理性蛋白质工程策略扩大PLD底物催化通道,降低大体积底物PC进入底物口袋的位阻效应,提高PLD转磷脂酰活性;同时通过提高活性位点His462与L-serine的亲和力,降低水解反应速率,获得4个有益突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),组合突变后获得的最佳四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P的转化率达到55.6%、PS产量为42.3 g·L-1、kcat/Km为1.53 (mmol/L)-1s-1,分别比WT提高59.8%、59.6%、93.7%。转化率和产量进一步提高的原因在于,突变体催化腔体积增加到718.6 Å3,且活性位点与L-serine催化距离缩短0.6 Å、与竞争底物H2O的催化距离增加0.8 Å。在3 L规模转化体系中,最佳突变体的PS产量为50.4 g·L-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。