不同化学方法制备的抗性淀粉理化性质及表征研究

牛博文,徐 薇,张 彧

(大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034)

红薯,又名番薯、甘薯等,一年生草本植物,具有喜光、怕冷、耐旱、土壤适应力强、营养丰富等特点。红薯生长周期较短,一年内可多次播种且产量较高,在全世界热带、亚热带地区广泛种植,在我国大部分地区均可栽植[1]。

淀粉是一种廉价、可再生、完全可生物降解的高分子化合物,作为每日饮食中最普遍的碳水化合物,是人体主要能源供给物质,按照不同的营养分类,可分为快速消化淀粉、缓慢消化淀粉和抗性淀粉。抗性淀粉是不能被正常健康人体小肠消化吸收与酶解的淀粉[2],可以在结肠中被微生物群发酵或部分发酵生成短链脂肪酸,修改稳定肠道菌群,调节肠道健康[3]。从自身结构与不同制备方法可以大致分为五种类型:物理包埋淀粉(RS1)、抗性淀粉颗粒(RS2)、老化回生淀粉(RS3)、化学改性淀粉(RS4)与直链淀粉—脂质复合物(RS5)[4]。其中,RS4是经过一系列化学修饰后,在淀粉分子链引入化学官能团或改变分子结构,限制淀粉酶作用,常见的方法有酯化、醚化和交联。酯化淀粉是指淀粉分子中的羟基被有机酸或无机酸酯化而得到的改性淀粉,钱大钧等[5]通过以玉米淀粉为原料,醋酸乙烯酯为酯化剂,以取代度为指标,确定最佳工艺条件,并研究其理化性质,证明酯化淀粉透明度增加,凝沉性增强。醚化淀粉是淀粉中糖苷键或活性羟基与醚化剂通过氧原子连接起来的淀粉衍生物,彭丽等[6]把大米淀粉作为原料,氯乙酸为醚化剂,制备羧甲基淀粉,并研究了其冻融稳定性、透明度、膨胀度等理化性质。交联淀粉是由含有二元或多元官能团的交联剂与淀粉分子发生羟基反应(生成二醚键、二酯基等基团),从而将两个或多个淀粉分子交叉连接起来的网状结构高聚物,郭耀东等[7]使用六偏磷酸钠交联土豆淀粉,并测定了交联土豆淀粉的冻融稳定性、膨胀度、溶解度等性能。

目前,对于抗性淀粉大多是单一研究其制备工艺及理化性质,本试验通过酯化[8]、醚化[9]、交联[10]三种不同化学方法制备抗性淀粉,初步分析不同化学方法所制得的抗性淀粉在结构上的异同,并研究不同结构对抗性淀粉理化性质的影响,以完善多种化学改性淀粉间的对比研究,为其在不同领域的应用提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红薯淀粉 大连经济开发区林梅食品有限公司;醋酸、无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司;氢氧化钠、碱性硫酸钠 天津市东丽区天大化学试剂厂;盐酸、柠檬酸、磷酸氢二钠 天津市大茂化学试剂厂;氯乙酸 天津市申泰化学试剂有限公司;三偏磷酸钠 阿拉丁试剂有限公司;耐高温淀粉酶(4万U/g) 源叶生物有限公司;糖化酶(10万U/g) 美伦生物有限公司;所有试剂均为分析纯。

B351136409pH计 METTLER TOLEDO仪器有限公司;DK-S26型数显恒温水浴锅 金坛金城教学仪器厂;90-1型搅拌器 上海沪西分析仪器厂有限公司;DGG-9240A电热鼓风干燥箱 宏华仪器设备有限公司;SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;UV-2600紫外分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司;ME204E电子天平 METTLER TOLEDO仪器有限公司;SHZ-III循环式多用真空泵 上海亚荣生化仪器厂;JSM-7800F场发散扫描电子显微镜 日本电子公司;Spectrum two傅立叶变换红外光谱仪 铂金埃尔默仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 醋酸酯化淀粉的制备 取35 g红薯淀粉于100 mL烧杯中,配成40%的淀粉乳液,置于35 ℃的水浴锅恒温,均速滴加3%(以淀粉干基为标准,w/w)醋酸溶液并搅拌均匀,反应过程中持续滴加1 mol/L氢氧化钠溶液,控制溶液pH为8,反应1 h后,滴加0.5 mol/L盐酸溶液,调节溶液pH至中性,停止反应,过滤并水洗过滤物3次,洗去过滤物中残余的醋酸,取水洗后的沉淀置于45 ℃烘箱烘干,粉碎后过100目筛,备用[11]。

1.2.2 羧甲基醚化淀粉的制备 取31.75 g氢氧化钠颗粒与30 g红薯淀粉,加入三口烧瓶中,加入85%乙醇溶液配成30%淀粉乳液,搅拌均匀,移入30 ℃恒温水浴锅中加热碱化60 min,加入37.50 g一氯乙酸固体,搅拌均匀,设置反应温度40 ℃,醚化4 h,反应结束后用盐酸滴定溶液pH至中性,用85%乙醇冲洗4～5次至溶液中无氯离子,抽滤得到白色固体或粉末,45 ℃烘干,粉碎,过100目筛[12]。

1.2.3 磷酸交联淀粉的制备 称取30 g淀粉和3 g Na2SO3配成40%淀粉乳,搅拌均匀,缓慢滴加0.3%(以淀粉干基为标准,w/w)的三偏磷酸钠,保证反应温度保持在45 ℃,反应4 h,反应过程中保证pH为8.5,反应结束后中和反应液为中性,过滤并水洗过滤物4～5次,50 ℃烘干,粉碎,过100目筛[13]。

1.2.4 抗性淀粉分离纯化 取1.2.1、1.2.2、1.2.3制得的抗性淀粉,加柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配成20%淀粉乳,调节溶液pH为6,加足量耐高温α-淀粉酶,沸水浴振荡30 min,调节溶液pH在4～4.5,加适量糖化酶,60 ℃水浴振荡30 min,取酶解后溶液,3500 r/min离心15 min,水洗三次,去除上清液,取沉淀物在45 ℃烘干,粉碎,过100目筛[14]。

1.3 理化指标测定与表征分析

1.3.1 抗酶解性 取2 g样品,溶于20 mLα-淀粉酶,加入20 mL醋酸钠缓冲液,置于37 ℃水浴锅振荡4 h,分别在30、60、90、120、150、240 min取1 mL上清液加6 mL无水乙醇灭酶,加10 mL去离子水,3000 r/min离心15 min,取上清液定容至100 mL,在620 nm下测定吸光度[15]。

y=2×(1.5986x-0.057)

式中:y表示还原糖量,x表示吸光度。

1.3.2 持水性 分别称取1 g样品溶解于15 mL去离子水,分别置于45、55、65、75、85 ℃水浴加热30 min,冷却至室温,3000 r/min离心15 min,弃上清液,称量沉淀重量[16]。

式中:m2表示离心后离心管加沉淀物重量,g;m1表示离心管重量,g。

1.3.3 透明度 取1 g样品加水配成1%的溶液,沸水浴加热15 min,冷却至室温,以蒸馏水为空白对照,用紫外分光光度计在620 nm下测量透光率。透光率越高,透明度越高[17]。

1.3.4 溶解度和膨润度 取1 g样品于离心管中溶于100 mL蒸馏水中,在95 ℃水浴振荡30 min,在3000 r/min离心15 min,取上清液烘干至恒重,称量沉淀和离心管总重,计算溶解度[18]。

式中:m1表示离心管重量,g;m2表示上清液烘干后恒重,g;m3表示离心后沉淀物加离心管重量,g。

1.3.5 冻融稳定性 取2 g样品于离心管,配成6%淀粉乳,沸水浴加热20 min,冷却至室温,在-20 ℃冷冻24 h,取出自然解冻,在3500 r/min离心15 min,去除上清液,称重,测定析水率。析水率与冻融性呈反比[19]。

式中:m1表示离心管重量,g;m2表示离心管加淀粉乳重量,g;m3表示离心后离心管加沉淀重量,g。

1.3.6 电镜扫描 用95%乙醇分别将干燥的样品分散在金属载体上,待乙醇挥发干后,将分散好的样品颗粒表面喷洒铂金。用扫描电子显微镜放大不同倍数,观察淀粉和抗性淀粉的形貌特征[20]。

1.3.7 红外光谱分析 将待测干燥样品在l:10比例下与溴化钾充分混合、研磨,并对样品压片成型,压片后将其放入红外光谱仪检测,设定的波数范围4000～400 cm-1,分辨率为l cm-1[21]。

1.4 数据处理

结果表示为平均值±标准差,分析结果采用Excel软件进行数据统计分析,对数据进行单因素方差分析和显著性差异检验,并用Excel和Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 抗酶解性

如图1所示,淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉和交联淀粉经足量α-淀粉酶酶解0.5 h后,淀粉与交联淀粉溶液析出0.18、0.01 g还原糖;酶解1 h后,淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉溶液分别析出0.39、0.02、0.07和0.12还原糖;酶解2.5 h后,淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉溶液分别析出0.72、0.17、0.13和0.29 g还原糖,继续酶解至4 h,溶液中还原糖量无明显变化,证明经过三种化学改性后的淀粉较淀粉具有较强抗酶解性,与羊云龙等[22]描述结果大致相同。并且,酯化淀粉和羧甲基醚化淀粉酶解后还原糖量大致相同,是因为碱液破坏淀粉分子糊化后,淀粉颗粒崩溃,支链断裂形成众多游离直链淀粉,与醋酸分子接触重排,形成新的酯基位阻结构[23-24],而醚化反应中游离糖苷键和羟基与氧原子结合形成新的淀粉衍生物,自由组合成新的更稳定的结晶结构,酶分子难进入分子内部,淀粉难以被酶解[12]。然而,交联反应中,淀粉颗粒表面分子被磷酸根交联,束缚淀粉粒形成新的空间网状结构,使淀粉粒不易膨胀、崩溃,保护内部架构,阻碍酶分子攻击,但交联度较低时,部分淀粉分子被腐蚀,破坏了结晶区结构,分子层结构发生改变,导致少量酶分子进入分子内部,抗酶解能力略低于酯化淀粉和羧甲基醚化淀粉[25]。

图1 原淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉抗酶解性比较

2.2 持水性

由图2可知,三种抗性淀粉持水性均优于原淀粉,其中,羧甲基醚化淀粉持水性最强,醋酸酯化淀粉持水性整体略优于磷酸交联淀粉。这是因为羧甲基醚化淀粉引入-COO-亲水性官能团、醋酸酯化淀粉引入乙酰基官能团、磷酸交联淀粉引入磷酸酯基团,抑制淀粉分子链的结合,通过淀粉分子链上的羟基产生范德华力,把水分子锁在网状结构中,淀粉分子在水中形成亲水性胶体,随着温度的升高,淀粉分子逐渐糊化断裂,生成更多氢键。由于基团极性不同,所以羧甲基醚化淀粉持水性高于醋酸酯化淀粉，均高于磷酸交联淀粉[26]。

图2 原淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉持水性比较

2.3 透明度、溶解度、膨润度

从表1可知,与原淀粉相比,醋酸酯化淀粉和羧甲基醚化淀粉透光率、溶解度和膨润度均有提高,但磷酸交联淀粉的透光率、溶解度与膨润度却明显低于原淀粉。主要是因为,酯化反应和醚化反应均引入了新的亲水性基团,阻碍了分子间缔合作用,减弱了光的折射与反射,且分子内部发生膨胀导致淀粉分子体积变大,增加了光的透过率,使淀粉糊透明度有效提高,溶解度与膨润度随之增加[27]。

表1 原淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉透光率、溶解度、膨润度比较

交联反应虽然同样引入亲水性磷酸基团,但分子链间连接的交联化学键增强了淀粉分子间颗粒强度,亲水性减弱,抑制了颗粒分子膨胀,降低了在水中的溶解度,容易发生凝沉,增加了光的折射与反射,减少了光的透射,因此磷酸交联淀粉透明度、溶解度与膨润度降低。

2.4 冻融稳定性

淀粉糊在冷冻状态下分子间氢键作用加强,发生凝沉作用,淀粉分子脱水收缩,导致游离水析出[28]。从表2可以看出,三种改性淀粉析水率均比原淀粉有所下降,因为三种改性淀粉均引入亲水性基团,可以使淀粉分子亲水力增强,减弱分子间氢键强度,减小脱水缩合作用,降低淀粉冷冻后的析水率。而羧基极性强于乙酰基强于磷酸基团,因此羧甲基醚化淀粉析水率小于醋酸酯淀粉小于磷酸交联淀粉。

表2 原淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉析水率

2.5 颗粒形态

用扫描电镜拍摄原淀粉和三种改性淀粉颗粒的照片,如图3所示。原淀粉颗粒表面光滑,多为大颗粒状且呈规律的圆形,许多大颗粒周围附有少量小颗粒淀粉。经酯化后淀粉原有颗粒形貌被破坏,颗粒表面凹凸不平,且颗粒与颗粒之间有粘连,说明淀粉分子表面和内部结构均因乙酰基的加入而被破坏,同时也由于有碱类物质的加入破坏了颗粒表面[29];经羧甲基醚化后淀粉,分子颗粒形貌大致与原淀粉分子相似,颗粒表面覆着许多细小颗粒,这可能是因为前期用碱液处理时破坏了颗粒结构,有一些较小淀粉颗粒被破坏后破碎,与一氯乙酸和氢氧化钠颗粒一同附着在淀粉颗粒表面,有一些淀粉分子表面出现轻微凹陷,但并不明显,可能是受到碱液腐蚀,说明羧甲基化反应主要发生在分子表面;经磷酸交联后淀粉颗粒形貌发生变化,不再呈圆滑规律的圆形,淀粉分子变成不规则多面体,分子表面有很多较小凹陷,是因为三偏磷酸钠与淀粉分子发生化学反应腐蚀分子表面。淀粉分子是层状结构,外部为结晶区,内部为非结晶区,因此很难与化学试剂发生反应,但是交联反应中磷酸酯基将两条无定型支链淀粉连接,形成致密网状结构,破坏淀粉分子层状结构,因此交联反应既发生在结晶区也发生在非结晶区[30]。

图3 原淀粉与酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉形态观察

2.6 红外光谱

图4 原淀粉与醋酸酯化淀粉、羧甲基醚化淀粉、磷酸交联淀粉红外图谱

3 结论

以红薯淀粉为原料,经醋酸酯化、羧甲基醚化和磷酸酯交联后得到三种不同抗性淀粉。通过测定抗酶解性,证明三种化学改性淀粉较原淀粉抗酶解性有很大提高,三种改性淀粉不易被酶解,符合抗性淀粉基本理论,证明了三者均为抗性淀粉;羧甲基醚化淀粉与醋酸酯化淀粉透明度、溶解度与膨润度都有较大提高,但磷酸交联淀粉反之下降。三种抗性淀粉持水性和冻融性均优于原淀粉,其中羧甲基淀粉具有更好的持水性和冻融性,明显强于醋酸酯化淀粉与磷酸交联淀粉;三种抗性淀粉颗粒原有形貌均有所改变,其中醋酸酯化淀粉和磷酸交联淀粉内外部结构均被破坏,已失去淀粉原有形貌,说明在分子内外部均发生化学反应,改变原淀粉内外结构。羧甲基醚化淀粉只在分子表面有轻微变化,说明化学反应并未进入分子内部,只发生在分子表面;经傅立叶红外光谱测定,证实醋酸酯化淀粉和羧甲基淀粉均产生新的化学键和新官能团乙酰基和羧甲基,磷酸交联淀粉虽未产生新的化学键,但是生成了新的磷酸酯基团。

通过上述分析结果可知,抗性淀粉总体性能均优于淀粉,其中酯化淀粉和醚化淀粉理化性质较相似,且整体结果优于交联淀粉,更能改善食品的光泽度和冷冻性,为食品添加剂等领域的应用打下了良好的理论基础。