lncRNA MAGI2-AS3下调miR-31-5p抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡

肺癌是世界上死亡率最高的癌症，是全球公共卫生的主要威胁[1]。过去三十年，中国肺癌的发病率和死亡率上升迅速[2]。大多肺癌确诊时已是晚期，通常采用放化疗等癌症控制方法，但预后较差，近年来靶向治疗的分子抑制剂也在进行临床试验[3]。肺癌的分子抑制靶点，是肺癌分子诊断治疗的研究重点和热点。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）在肺癌发生、癌细胞增殖、侵袭、转移和预后中具有重要的作用[4]，micro RNA（miRNA）的异常表达与肺癌的发生、发展和预后及耐药性密切相关[5]。lncRNA MAGI2-AS3（MAGI2 antisense RNA 3）在乳腺癌和膀胱癌组织中表达下调，与肿瘤的增殖、迁移和侵袭有关[6-7]。研究表明，MAGI2-AS3在非小细胞肺癌肿瘤发生过程中表达水平降低[8]，但是对细胞生物行为的作用机制尚不清楚。miR-31-5p在结直肠癌、肝细胞癌、肺癌、膀胱癌和胃癌等癌组织中的表达异常，miR-31可能参与肺癌的发生、发展并与肺癌肿块的大小相关[9]。miR-31在非小细胞肺癌患者血清中表达上调，与肺癌临床诊断和预后有关[10]。本研究的生物信息学预测发现，MAGI2-AS3和miR-31-5p含有互补结合序列。但两者在肿瘤中的关系尚不清楚，而两者作用机制和在肺癌中的关系也不清楚。本研究以人肺癌细胞系A549为研究对象，研究MAGI2-AS3对肺癌的影响，以及miR-31-5p在此机制中的作用。

材料与方法

一、材料

人肺癌细胞株A549和人正常肺细胞株HBE（美国ATCC公司）；F12K培养基、牛血清白蛋白（bovine serun albumin，BSA）、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚矾（dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（美国Sigma-Aldrich公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Gibco公司）；Transwell板（美国Corning公司）；双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase Reporter Assay System）（美国Promega公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂、RNA 提取试剂Trizol、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒、反转录试剂盒（RTPCR）（美国Invitrogen公司）；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪（美国BD公司）；显微镜、酶标仪及PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

二、方法

1.细胞培养：将A549细胞培养于含10﹪FBS、1﹪青-链霉素的F12K培养基中；培养条件：37℃ 5﹪ CO2培养箱，湿度95﹪。将细胞生长至对数生长期，消化传代。

2.细胞转染和分组：将传代后对数生长期的A549细胞稀释为1～2×l06个细胞/mL，以2×l05个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养细胞至融合为一层，进行转染。首先，用无血清培养液分别稀释脂质体Lipofectamine 2000、待转染载体，取等体积脂质体和各组载体混合，室温孵育20 min，加入到培养好的细胞孔板中，继续培养6 h，弃培养液，换成完全培养基，转染48 h，收集细胞。根据转染载体不同分为pcDNA3.1组（转染pcDNA3.1）、pcDNA3.1-MAGI2-AS3组（转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3）、anti-miR-NC组（转染anti-miR-NC）、anti-miR-31-5p组（转染anti-miR-31-5p）、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组（共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-NC）、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组（共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-31-5p mimics）。按照下述实验方法检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

3.qRT-PCR检测lncRNA MAGI2-AS3和miR-31-5p的表达：收集各组细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 2 μL，RNA 1 g，补水至10 μL；然后在42℃孵育2 min；再加入5×Prime Script Buffer 24 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，RT Prime mix 1 μL，补水至20 μL；37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃保存备用。取cDNA按照qRT-PCR的说明书进行反应，反应体系：2 μL反转录产物、10 μL SYBR Green Mix、Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，补水至20 μL；反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min。引物序列和扩增长度见表1。分别以GAPDH和U6为内参，运用Bio-Rad PCR系统分析MAGI2-AS3和miR-31-5p相对表达水平。

表1 引物序列信息

4.MTT实验检测细胞增殖：收集细胞，胰蛋白酶消化，用培养液稀释细胞，以2×103个/孔接种于96孔板中，继续培养，当培养至24、48、72 h 时进行MTT实验，每孔加入 20 μL（5 mg/mL）MTT，培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定490 nm 吸光度（OD）值。实验重复3次。

5.Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭：（1）迁移实验：收集对数生长期的细胞，加入含10 g/L BSA的无血清F12K培养基，稀释细胞为2×105个/mL。Transwell下层培养孔加入500 μL10﹪FBS培养基作为迁移趋化物，上层小室中加入100 μL细胞，将上层小室放入下层培养孔培养48 h，取出，棉签拭去基质胶和上层小室的细胞，4﹪多聚甲醛固定细胞，0.1﹪结晶紫染色，显微镜随机选取3个视野进行拍照和计数。实验重复3次。（2）侵袭实验：以4℃无血清F12K培养基1:3比例稀释Matrigel，加入上层Transwell 小室，烘干，以下步骤同迁移实验，培养48 h，固定细胞，染色，计数。

6.双荧光素酶报告实验：收集转染后A549细胞接种于24孔板中（1×104个细胞/孔），继续培养，观察若细胞融合为一层，进行转染，分别构建MAGI2-AS3的野生型（WT-MAGI2-AS3）和突变型（MUT-MAGI2-AS3）双荧光素酶报告载体，分别共转染miR-NC 或miR-31-5p，转染后48 h，收集细胞，RIPA 裂解液室温裂解20 min，离心收集上清，加入荧光素酶底物，发光仪检测活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对荧火虫荧光素酶活性。为证实MAGI2-AS3是通过调控miR-31-5p进而在肺癌中发挥作用，将si-NC、si-MAGI2-AS3、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MAGI2-AS3分别转染A549细胞，依次记为si-NC组、si-MAGI2-AS3组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MAGI2-AS3组。转染48 h后，按照qRT-PCR步骤检测miR-31-5p表达水平。si-MAGI2-AS3序列为5'-CCTTCACACTTCCTGCTAT-3'，si-NC序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。实验重复3次。

7.流式细胞术测定细胞凋亡率：收集各组A549细胞，稀释，以1×104个/孔接种于6孔板，继续培养72 h，Trypsin 消化，收集细胞，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶（PI）混匀，室温避光20 min，流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。实验重复3次。

8.流式细胞术测定细胞周期：收集各组A549细胞，用预冷的PBS洗涤3次，离心沉淀细胞，弃上清；然后重悬细胞，加入预冷的80﹪乙醇，4℃固定过夜；用PBS洗涤细胞3次，加入核糖核酸酶A（RNase A），37℃孵育30 min，加入碘化啶（PI）染色液，4℃染色15 min，上机检测激发波长488 nm处红色荧光，用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行分析。

三、统计学分析方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行数据分析，MAGI2-AS3、miR-31-5p表达、细胞增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭、荧光素酶活性数据均采用±s表示。两组间比较采用独立样本t检验进行分析；多组间比较采用单因素方差分析，组内多重比较采用SNK-q检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、lncRNA MAGI2-AS3和miR-31-5p在肺癌细胞A549和正常肺细胞HBE中的表达

qRT-PCR 结果表明，与HBE组相比，A549组的MAGI2-AS3表达量降低，miR-31-5p表达量升高，差异有统计学意义（P均＜ 0.05，表2）。

表2 MAGI2-AS3和miR-31-5p在细胞A549和HBE中的表达（±s，n= 3）

表2 MAGI2-AS3和miR-31-5p在细胞A549和HBE中的表达（±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 MAGI2-AS3 miR-31-5p HBE组 1.29±0.06 0.25±0.02 A549组 0.48±0.03 1.01±0.05 t值 20.914 24.444 P值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

二、过表达MAGI2-AS3抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡

qRT-PCR结果表明，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组的MAGI2-AS3的表达量上升（P＜ 0.05，表3）。MTT、流式细胞术结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组的细胞活性（OD 490 nm）在48、72 h均下降，细胞凋亡率上升，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，表3、图1）。流式细胞术结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组G0-G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例降低（P＜ 0.05，表4）。

三、过表达MAGI2-AS3抑制肺癌细胞A549 迁移和侵袭

Transwell结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组的A549细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均下降（P＜ 0.05，表5、图2）。

四、抑制miR-31-5p对肺癌细胞A549增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

qRT-PCR 结果表明，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-31-5p组的miR-31-5p的表达量下降（P＜0.05，表6）。MTT、流式细胞术、Transwell 结果显示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-31-5p组48、72 h时A549细胞活性（OD 490 nm）、迁移细胞数和侵袭细胞数均下降，细胞凋亡率上升，G0-G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例降低（P＜ 0.05，表6～7，图3～4）。

表3 过表达MAGI2-AS3对细胞 A549增殖凋亡的影响（±s，n= 3）

表3 过表达MAGI2-AS3对细胞 A549增殖凋亡的影响（±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 MAGI2-AS3 OD值凋亡率（﹪）24 h 48 h 72 h pcDNA3.1 0.42±0.03 0.46±0.03 0.77±0.06 1.03±0.08 7.23±0.51 pcDNA3.1-MAGI2-AS3 0.85±0.07 0.41±0.03 0.48±0.04 0.68±0.05 19.95±1.25 t值 9.779 2.041 6.966 6.426 16.319 P值 ＜ 0.001 0.111 0.002 0.003 ＜ 0.001

图1 流式细胞仪检测过表达MAGI2-AS3对细胞 A549 凋亡的影响

图2 光学显微镜下观察过表达MAGI2-AS3对细胞A549 迁移、侵袭细胞数的影响（结晶紫染色，×200）。 pcDNA3.1-MAGI2-AS3组（2b图）细胞迁移数目较pcDNA3.1组（2a图）减少；pcDNA3.1-MAGI2-AS3组（2d图）细胞侵袭数目录较pcDNA3.1组（2c图）减少

表4 过表达MAGI2-AS3对细胞 A549细胞周期的影响（﹪，±s，n= 3）

表4 过表达MAGI2-AS3对细胞 A549细胞周期的影响（﹪，±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 G0-G1 S G2-M pcDNA3.1 33.56±1.23 32.95±1.06 33.49±1.61 pcDNA3.1-MAGI2-AS3 43.58±2.15 23.01±1.00 33.41±1.60 t值 7.007 11.814 0.061 P值 0.002 ＜ 0.001 0.954

表5 过表达MAGI2-AS3对细胞A549 迁移、侵袭的影响（个，±s，n= 3）

表5 过表达MAGI2-AS3对细胞A549 迁移、侵袭的影响（个，±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 迁移细胞数 侵袭细胞数pcDNA3.1 124.33±3.09 53.00±3.27 pcDNA3.1-MAGI2-AS3 81.33±2.87 32.00±2.83 t值 17.660 8.411 P值 ＜ 0.001 0.001

五、lncRNA MAGI2-AS3靶向调控miR-31-5p的表达

Targetscan 软件预测结果显示，MAGI2-AS3序列中含有与miR-31-5p互补的核苷酸序列（图5）。双荧光素酶报告系统结果如表8所示，与miR-NC组相比，miR-31-5p组野生型WT-MAGI2-AS3的荧光素酶相对活性下降（P＜ 0.05）；而突变型MUTMAGI2-AS3的荧光素酶相对活性没有明显变化。qRT-PCR 结果表明，与pcDNA3.1组（0.94±0.08）相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组的miR-31-5p表达量（0.34±0.03）下降（t= 12.163，P＜ 0.001）；与si-NC组（0.96±0.08）相比，si-MAGI2-AS3组的miR-31-5p表达量（1.56±0.12）上升（t= 7.206，P=0.002）。

表6 抑制miR-31-5p对细胞A549增殖、凋亡的影响（±s，n= 3）

表6 抑制miR-31-5p对细胞A549增殖、凋亡的影响（±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 miR-31-5p OD值凋亡率（﹪）24 h 48 h 72 h anti-miR-NC组 1.02±0.06 0.47±0.03 0.78±0.06 1.05±0.08 7.29±0.51 anti-miR-31-5p组 0.48±0.03 0.42±0.03 0.53±0.04 0.76±0.06 18.21±1.24 t值 13.943 2.041 6.005 5.023 14.107 P值 ＜ 0.001 0.111 0.004 0.007 ＜ 0.001

表7 抑制miR-31-5p对细胞A549 迁移、侵袭及细胞周期的影响（±s，n= 3）

表7 抑制miR-31-5p对细胞A549 迁移、侵袭及细胞周期的影响（±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 G0-G1（﹪）S（﹪）G2-M（﹪）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）anti-miR-NC组 33.53±1.27 32.91±1.08 33.56±1.68 108.33±2.87 42.33±2.05 anti-miR-31-5p组 41.56±2.19 24.43±1.13 34.01±1.23 76.00±3.74 30.00±1.63 t值 5.494 9.397 0.374 11.878 8.154 P值 0.005 0.001 0.727 ＜ 0.001 0.001

图3 流式细胞仪检测抑制miR-31-5p对细胞A549 凋亡的影响

图4 光学显微镜下观察抑制miR-31-5p对A549细胞迁移和侵袭的影响（结晶紫染色，×200）。anti-miR-31-5p组（4b图）细胞迁移数目较anti-miR-NC组（4a图）减少；anti-miR-31-5p组（4d图）细胞侵袭数目较anti-miR-NC组（4c图）减少

六、过表达miR-31-5p可逆转上调MAGI2-AS3对细胞A549增殖、迁移、侵袭的抑制作用和凋亡促进作用

MTT、Transwell、流式细胞术结果（表9，图6～7）显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3组48、72 h的A549细胞活性（OD 490 nm）、迁移细胞数和侵袭细胞数均下降，细胞凋亡率上升（P均＜ 0.05）；与pcDNA3.1-MAGI2-AS3组、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组相比，pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组48、72 h的A549细胞活性（OD 490 nm）在48、72 h均上升，迁移细胞数和侵袭细胞数均上升，细胞凋亡率下降（P均＜ 0.05）。说明过表达miR-31-5p可逆转上调MAGI2-AS3对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用和凋亡促进作用。

表8 双荧光素酶报告实验（±s，n= 3）

表8 双荧光素酶报告实验（±s，n= 3）

注：n为实验重复次数

分组 WT-MAGI2-AS3 MUT-MAGI2-AS3 miR-NC组 1.01±0.06 1.01±0.05 miR-31-5p组 0.23±0.02 1.00±0.05 t值 21.361 0.245 P值 ＜0.001 0.819

图5 MAGI2-AS3 靶向miR-31-5p

图6 流式细胞仪检测过表达miR-31-5p 能逆转MAGI2-AS3对细胞A549的凋亡影响

图7 光学显微镜下观察过表达miR-31-5p能逆转MAGI2-AS3对细胞A549迁移、侵袭的影响（结晶紫染色，×200）

表9 过表达miR-31-5p 能逆转lncRNA MAGI2-AS3对细胞A549的凋亡、增殖及迁移、侵袭的影响（±s，n= 3）

表9 过表达miR-31-5p 能逆转lncRNA MAGI2-AS3对细胞A549的凋亡、增殖及迁移、侵袭的影响（±s，n= 3）

注：与pcDNA3.1组比较，aP＜ 0.05；与pcDNA3.1-MAGI2-AS3组比较，bP＜ 0.05；与pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组比较，cP＜ 0.05；n为实验重复次数

分组 miR-31-5p OD值凋亡率（﹪）迁移细胞数 侵袭细胞数24 h 48 h 72 h pcDNA3.1组 1.02±0.08 0.47±0.04 0.76±0.07 1.04±0.09 7.23±0.51 125.00±2.16 81.67±2.49 pcDNA3.1-MAGI2-AS3组 0.34±0.02a 0.42±0.04 0.49±0.04a 0.69±0.05a 20.59±1.11a 53.33±2.87a 32.33±2.35a pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组 0.35±0.02a 0.43±0.04 0.50±0.04a 0.71±0.05a 21.11±1.14a 52.67±2.62a 31.67±4.03a pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组 0.78±0.06abc 0.44±0.04 0.68±0.06abc 0.95±0.07abc 10.59±1.01abc 91.00±1.63abc 62.67±2.49abc F值 558.665 2.625 55.256 60.850 155.664 642.749 207.998 P值 ＜ 0.001 0.067 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

讨 论

肺癌是全世界最大的癌症杀手，吸烟是肺癌的主要原因[11]。2015年我国的肺癌新发病例约55万例，死亡约49.5万例[12]。现阶段，研究肺癌的分子抑制机制，是肺癌精准治疗的关键。

现有研究表明，lncRNA与miRNA可通过相互调控作用促进或抑制肿瘤的形成、进展[13]。多个lncRNA和miRNA对肺癌的增殖、侵袭、转移、预后及诊断等起重要作用[14-15]。Yin 等[16]研究发现，MAGI2-AS3在肝癌组织中的表达下调，并且与一些临床特征（肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤坏死因子分期）和较差的总生存率密切相关，MAGI2-AS3 通过靶向miR-374b-5p/SMG1 信号通路抑制肝癌细胞增殖和迁移。Du 等[17]研究发现，MAGI2-AS3在乳腺癌组织中的表达下调，过表达MAGI2-AS3可通过靶向miR-374a/PTEN 通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。Luo 等[18]研究表明，非小细胞肺癌患者血浆和血小板中MAGI2-AS3的水平明显低于健康对照组，MAGI2-AS3水平与肿瘤转移（TNM）分期、淋巴结转移、远处转移有相关性。Hao 等[19]最新研究发现，MAGI2-AS3在NSCLC中表达下调，过表达MAGI2-AS3 通过miRNA-23a-3p/PTEN 轴抑制NSCLC的增殖和侵袭能力。本研究发现，MAGI2-AS3在肺癌细胞A549中表达量降低，过表达MAGI2-AS3可以抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，与上述结果一致，且过表达MAGI2-AS3 还可阻滞细胞周期，说明MAGI2-AS3在肺癌的进展中发挥重要作用[19]。

miR-31-5p在多种肿瘤组织中表达异常，与肿瘤增殖、进展和预后有关。Yi-Hsuan 等[20]发现，miR-31-5p在口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中表达上调，其通过靶向ACOX1 改变脂质代谢，从而导致细胞内信号改变增强细胞的运动，调控癌细胞迁移和侵袭。Fu 等[21]研究发现，miRNA-31-5p 过表达降低了细胞周期蛋白A2（Cyclin A2）的水平，并抑制人精原干细胞的增殖。Zhao 等[22]miR-31-5p 过表达抑制肝癌细胞的生长，迁移和侵袭，且降低了细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达。Yan 等[23]发现在肺腺癌组织中，miR-31-5p表达量上升，高表达水平的患者具有较长的生存期。Zhu 等[24]研究表明，miR-31-5p在肺癌H1299和A549细胞系中表达量上调，过表达miR-31-5p可通过靶向FIH 增强Warburg 效应，上调有氧糖酵解基因维持能量平衡，增强糖酵解和ATP的产生，促进细胞增殖。本研究结果发现，miR-31-5p在肺癌细胞A549中表达量上调，与Yan 等[23]和Zhu 等[24]结果一致；抑制miR-31-5p可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，证实了miR-31-5p在肺癌中具有重要作用。

通过对两者序列进行生物信息学分析，本研究发现，MAGI2-AS3序列中含有与miR-31-5p互补的核苷酸序列，预示MAGI2-AS3与miR-31-5p之间可能存在结合位点或者调控关系。通过进一步双荧光素酶报告系统实验结果发现，MAGI2-AS3靶向负调控miR-31-5p的表达。本研究证实了，在肺癌A549细胞中MAGI2-AS3和miR-31-5p之间的调控关系。

本研究首次阐述了，在肺癌A549细胞中，上调MAGI2-AS3可靶向抑制miR-31-5p的表达，进而抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。MAGI2-AS3是肺癌的潜在分子靶点，为肺癌的分子靶向治疗提供了新的方向。本研究仅在肺癌细胞A549中探讨了MAGI2-AS3的生物学功能，至于其具体的功能和机制仍需在多种肺癌细胞系中验证。