肽基脯氨酰顺反异构酶及细胞周期蛋白D1在胃肠间质瘤中表达的临床意义

王邓超，王 勇，余 淼，杨玉辉，雷跃华，李 曦，魏 健，张 陈

(1.四川省自贡市第四人民医院 a.普通外一科，b.病理科，四川 自贡 643000；2.四川省卫生康复职业学院基础教研室，四川 自贡 643000)

胃肠间质瘤(GIST)的起病机制是和基因发生的突变密切有关[1]。肽基脯氨酰顺反异构酶(Pin1)目前被公认是在多种肿瘤发生中的具有催化作用的因子，它不仅可以通过多种途径诱导正常细胞发生增殖，还能够阻止正常细胞的凋亡进而导致肿瘤的产生[2]。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)是对细胞周期的调控起着重要的调控作用，过度表达的细胞周期蛋白D1会使原本正常生长的细胞出现持续增殖的状态，进而导致正常细胞转化为恶性[3]。Pin1与CyclinD1二者之间产生相互作用而共同调节着细胞的周期[4]。本研究应用免疫组化方法检测55例胃肠间质瘤组织及其瘤旁正常组织中Pin1和CyclinD1的表达情况，探讨Pin1、CyclinD1在胃肠间质瘤发生中的作用机制以及二者与临床病理特征方面的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料2014～2019年在我科通过手术切除的胃肠间质瘤的肿瘤组织及瘤旁正常组织共计55例，瘤旁组织定义为同一患者与间质瘤肿瘤组织边缘的距离大于0.5 cm的组织，术后病检证实该组织中无肿瘤细胞的存在。所有纳入的研究对象属于原发性胃肠间质瘤；患者手术之前均没有口服伊马替尼等药物进行辅助治疗；经胸腹CT或者磁共振排除合并其他系统的恶性肿瘤。其中男28例，女27例；年龄>50岁31例，<50岁24例；极低危险度3例，低危险度10例，中危险度18例，高危险度24例。

1.2 方法①组织标本经10%的福尔马林溶液固定24小时后进行解剖、脱水、石蜡包埋、切片。②采取SP法(链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法)对标本进行免疫组化染色。通过切片加热、脱蜡、抗原修复、加入抗体、苏木紫复染、透明、固定、室温下晾干、封片等步骤完成。

1.3 结果判断所有组织的染色切片均由我院病理科两位富有阅片经验的病理医师在同一条件下用光学显微镜采用双盲法的方式进行染色图片阅片。参考NakashimaCritical标准[5]，Pin1结果的判定由染色强度分值及染色阳性细胞数分值的乘积决定：染色强度分值： 没有染色者计为0分，出现淡黄色的染色颗粒计为1分，出现较多的棕黄色染色颗粒计为2分，出现大量棕黄色染色颗粒计为3分；阳性细胞数分值： 阳性细胞出现率低于1%者设为0分，阳性细胞出现率1%～33%者设为1分，阳性细胞出现率34%～66%者设为2分，阳性细胞出现率≥67%者设为3分；如果染色强度分值和阳性细胞数分值之乘积低于3分时将结果判定为阴性(-)；当二者的乘积大于3分时将结果判定为阳性(+)。CyclinD1结果判定：当组织的细胞核和(或)胞浆呈现出红色的染色颗粒将CyclinD1的结果定为阳性细胞，如果阳性细胞数低于10%将结果判定为阴性(-)，阳性细胞率高于10%将结果判定为阳性(+)。

1.3 统计学方法应用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析。计数资料的比较采用χ2检验或确切概率法；计量资料用均数±标准差，比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Pin1蛋白与CyclinD1蛋白在胃肠间质瘤肿瘤组织中的阳性表达率74.5%(41/55)，而在间质瘤的瘤旁组织的表达阳性率却为0%，两者之间差异有统计学意义(χ2=65.36，P<0.05)。Pin1蛋白的阳性表达状态在GIST的不同危险度分级中表达存在差异(P<0.05)，在GIST患者不同性别、年龄、间质瘤的核分裂象水平、间质瘤瘤体的直径、肿瘤所位于的位置、间质瘤肿瘤细胞的形态、肿瘤是否存在远处转移组间无差异(P> 0.05)。CyclinD1蛋白在胃肠间质瘤肿瘤组织的表达阳性率58.2%(32/55)，而在间质瘤的瘤旁组织表达阳性率为0%，差异有统计学意义(χ2=45.13，P<0.05)。CyclinD1的阳性表达状态在不同GIST的危险度分级中表达存在差异(P<0.05)，在GIST患者不同性别、年龄、间质瘤的核分裂象水平、间质瘤瘤体的直径、肿瘤所位于的位置、间质瘤肿瘤细胞的形态、肿瘤是否存在远处转移组间无差异(P> 0.05)。见表1。Pin1与CyclinD1蛋白在55例GIST瘤体组织中均呈现阳性表达的例数为29例，均呈现阴性表达的例数为11例。

表1 Pin1及CyclinD1在胃肠间质瘤组织中的表达阳性率及与临床病理特征的关系 [n(%)]

3 讨论

GIST是一种由间叶组织来源的肿瘤[6]，大部分该肿瘤可以表达CD117和DOG1，且大多数该肿瘤存在着C-KIT(和)或PDGFRA的活化突变[7]。即使是GIST的原发病灶通过靶向药物治疗联合规范化的手术切除后其复发率也仍较高[8]。因此在GIST的发病病因、诊断以及治疗上迫切需要寻找新的可行途径。细胞周期的调控与肿瘤的发生有着紧密联系，其中肽基脯氨酞顺反异构酶(Pin1)以及细胞周期素D1(CyclinD1)在正常细胞出现癌变的发展过程中起着至关重要的影响，目前已经在人类的多种肿瘤细胞中发现两种蛋白质呈现出过度表达状态[9]。Pin1与肿瘤发生发展中的作用引起了医学界的广泛关注。Pin1的表达水平状态与细胞分裂紧密联系，在正常细胞中Pin1活性状态一般很低，然而它在分裂旺盛的细胞中(如大多数肿瘤细胞)却较容易被检测到；在高度分化的细胞中Pin1呈现出低表达状态或几乎难以检测到它的存在，目前研究发现Pin1的调控紊乱将引起人类多种疾病的发生，在肿瘤的发生发展中它的作用尤为突出[10]，通过本研究中可以看出，Pin1蛋白在瘤旁组织中呈不表达状态或仅仅只是在核中呈很微弱的表达，而它在本研究中的间质瘤瘤体组织中则呈现出过表达的状态。Pin1可以通过多种有丝分裂蛋白对细胞产生影响，因此它能够参与到细胞的周期调控中而发挥作用。在早期的有关细胞周期研究中发现，通过外界作用去除Pin1的细胞将会停滞于有丝分裂期，然而如果细胞中的Pin1出现过度表达状态却会导致本来正常生长的细胞停滞于G2期[11]。研究表明，Pin1如果在细胞中呈现过度表达的状态会引起正常乳腺上皮细胞朝着恶性方向转化，同时已经被诱导的恶性表型也会加强，然而敲除细胞的Pin1之后，这种由诱导而呈现出的恶性表型则会出现逆转，最后将引起癌细胞的调亡[12]。大量分子生物学研究以及Pin1抑制剂的研究表明，Pin1在未来抗癌药物的研制中有望成为一个新的理想的靶标。

CyclinD1作为细胞周期蛋白的与肿瘤的发生发展以及肿瘤的预后都有着紧密的联系。在近年研究中发现，CyclinD1在膀胱恶性肿瘤、乳腺恶性肿瘤、甲状旁腺肿瘤、淋巴瘤、肺恶性肿瘤等恶性肿瘤中的基因过表达以及基因扩增都密切相关。已经证实CyclinD1是细胞周期成分中与肿瘤的发生有最直接联系的癌基因，它的致癌机制是通过作用于G1期的多种蛋白，与这些蛋白产生相互影响，进而导致细胞周期从G1期进入S期，这样就加快了细胞周期的速度，最终导致正常生长的细胞产生恶性变。G1期的CyclinD1表达在正常情况下是恒定的，然而在基因扩增、易位的情况下就会引起CyclinD1呈现出过表达的状态，这将会使得细胞周期缩短，进而异常细胞增殖紊乱及不断堆积，最终导致细胞癌变发生[13]。研究表明，CyclinD1除了作为原癌基因的身份以外还是重要靶基因之一，pin1可以通过两种途径调控CyclinD1的表达，一是在转录水平上引起CyclinD1转录；二是通过诱导CyclinD1发生构型改变，进而防止CyclinD1从细胞核往细胞浆中迁移发生降解，引起CyclinD1呈现过表达的状态，最终细胞发生转化和增殖[14]。

本研究的相关结果表明，Pin1与CyclinD1在间质瘤组织的的阳性表达情况在不同危险度组间表达存在差异。但我们在该研究的统计中发现CyclinD1的阳性表达在不同间质瘤的瘤体直径组间表达无差异，与国内黄子成等[15]的研究不相一致，提示不同类型的肿瘤细胞表达情况不尽相同，也可能与我们的胃肠间质瘤标本量小有关，也提示了在不同细胞类型的肿瘤中，可能通过不同的机制对不同细胞的生物学行为产生不尽相同的影响。GIST组织中Pin1、CyclinD1呈现过表达的状态，且二者的表达水平高低与GIST的危险度有关，这样就表明GIST的发病病因与Pin1和 CyclinD1二者在间质瘤组织中表达过度所引起的正常细胞出现增殖异常有关，二者在GIST的发生发展过程中可能起着相互促进、协同的影响，影响着GIST 的发生以及演变，甚至间质瘤的预后，希望该理论依据能够可以为胃肠间质瘤的今后临床上新的治疗提供方向。但是本研究纳入的间质瘤例数较少，未能对不同基因突变类型、分子靶向治疗前后情况以及随访不同的预后进行对比和探讨，还需要更多的资料及多中心进一步的研究和分析，将有助于进一步阐明Pin1和CyclinD1在胃肠间质瘤中发生、发展的作用及其临床病理特征、预后的关系。