首次从喜马拉雅旱獭分离布鲁氏菌与鉴定

谢 辉，薛红梅，于守鸿，徐立青，马 丽，杨旭欣，张爱萍

布鲁氏菌病由布鲁氏菌引起的人兽共患病，严重危害人类健康和畜业发展。布鲁氏菌广泛分布于野生动物中[1-3]，如野猪、野牛等可造成布病自然疫源地形成的原因，曾报道新疆地区旱獭布菌血清学调查感染率为0.92%[4]， 1982年在青海海北州海晏县检测340份旱獭，血清学检测阳性率为3.25%，1986年在果洛州达日县检测喜马拉雅旱獭1 117份，血清学检测1.88%，1994年在海西州天峻县检测80份旱獭血清样品，阳性率2.5%[5-7]，可以推断喜马拉雅旱獭可以感染布病，但未能从旱獭体内分离出布鲁氏菌。2016年我们检测喜马拉雅旱獭245份，阳性率5.31%，并在血样品中分离出一株疑似布鲁氏菌株。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1样品 为旱獭全血，喜马拉雅旱獭全血245份采用虎红平板凝集反应(RPTB)试管凝集反应(SAT),噬菌体试验及染料抑菌试验。

1.1.2试剂 改良布鲁氏菌肝浸液培养基本所自制，双相培养基(20160430)布鲁氏菌虎红凝集试验抗原(2016-1)、凝集试管抗原(2016-2)、因子血清(A.M.R)、噬菌体(Tb、Wb、Bk)由青岛众创生物科技有限公司提供，柯氏染色由索宝莱生物科技有限公司提供，醋酸铅纸条、硫堇纸片、复红纸片由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

鉴定用参考菌株：国家标准菌株牛104、羊M5、猪S2均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.2方 法

1.2.1血清学检测 使用虎红平板凝集试验对旱獭血清进行布鲁氏菌阳性抗体的初筛，阳性血清行布氏菌凝集试验，按照《布氏菌试管(GB/T18646)》判定结果。

1.2.2细菌分离 无菌操作采集旱獭心脏全血，取5 mL加入改良肝浸液双相培养基及市售双相血培养基，45°倾斜，使血液均匀分布在琼脂斜面上，置37 ℃温箱培养，观察30 d。

1.2.3主要鉴定方法 1) 柯丝罗夫斯基法及革兰氏染色法，观察菌体形态、染色特征； 2)对CO2的需要；3)H2S产生测定；4)染料抑菌试验；5)A、M、R单因子血清凝集试验，结果对照布鲁氏菌属分类表。

2 结 果

2.1血清学检测 共检测245份旱獭血清，其中13份血清虎红平板凝集试验及试管凝集试验均呈阳性，血清抗体最高滴度为1∶400。

2.2细菌分离 采集旱獭全血先接种于血液增菌液后培养于改良肝浸液培养基和双相血培养基37 ℃培养，第7 d可见优化肝浸液培养基上生长无色透明、圆形湿润菌落，直径为0.6～1 mm，表面凸起，边缘整齐，在改良肝浸液琼脂上，培养物呈分散状，疑似布鲁氏杆菌。

2.3鉴 定

2.3.1菌落与菌体形态 菌落为无色透明、圆形、稍隆起、表面光滑、均质样，菌体为革兰氏阴性球杆菌，呈单个排列，柯氏染色为红色，见图1。

图1 柯氏染色倒置显微镜100倍34号菌株菌体形态Fig.1 Morphology of strain no.34 100 times under an inverted microscope with kirschner staining

2.3.2种型鉴定 经布鲁菌常规系列鉴定，并对照布鲁氏菌属的分类表，确定为羊种生物3型布鲁氏菌，见表1。

表1 喜马拉雅旱獭布菌鉴定表Tab.1 Identification of brucella from the Himalayan marmot

3 讨 论

根据34号菌落特征、细菌形态、染色特征、生长情况以及某些生化特性, 与羊种布鲁氏杆菌标准菌株特性一致，初步鉴定34号菌株为羊种布氏菌。从喜马拉雅旱獭体内分离出羊种布鲁氏杆菌，这在国内外首次发现。本实验通过对喜马拉雅旱獭布菌血液初分离时，由于杂菌生长抑制布鲁菌，菌落发育不良，需增加刺激目的菌的试剂同时抑制杂菌，再进行分纯培养[8]，如直接全血接种培养基，菌株生长缓慢[9-10]，初培养时不需要CO2,最适宜温度为37 ℃, 34号菌增菌后在改良肝浸液培养基生长良好。喜马拉雅旱獭布菌在一般培养基上不易生长，在优化的肝浸液培养基上生长良好，检出率较高，13份抗体阳性血液有1份检出细菌。

1985年WHO布鲁氏菌委员会将布鲁氏杆菌分为6个种19个生物型，我国已分离15个生物型，分别为羊种布鲁氏菌3个型，牛种布鲁氏菌8个型，猪种布鲁氏菌2个型，绵羊附睾种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌个1个型，其中羊布鲁氏菌的致病力最强[11-13]传染面广,危害严重。从喜马拉雅旱獭体内分离羊种布鲁氏菌对于研究该病的致病性、流行特点、探讨青藏高原喜马拉雅旱獭对布病传播的意义，对了解青藏高原布鲁氏杆菌保存机理及疫情变化提供理论依据。

喜马拉雅旱獭是鼠疫菌的主要宿主，本试验从喜马拉雅旱獭血液中分离出布鲁氏杆菌，这一发现对于鼠防人员从事血清样本检测时，在生物安全防护方面提供新的思路。

利益冲突：无