逐水巴布贴质量标准的研究*

★ 欧阳炜 张诚光 朱雅玲（广东省第二中医院 广州 510095）

恶性胸水恶性肿瘤引起的胸腔积液，患者的生存质量差，西医常用治疗方法都属于有创治疗，易复发还会带来各种并发症，对于晚期肿瘤患者并不适用［1］。逐水膏为广东省第二中医院专家的临床验方，从恶性胸腔积液病机出发，依据中医学“内病外治”理论研治的中药外用制剂。以十枣汤为基础方去大枣，结合甘草反甘遂、大戟、芫花的相反理论，加甘草、水蛭而成。功效峻下逐水、破血攻毒，将其贴敷于具有行气利水之穴位，以疏导调理经络气血，畅利水道，主要用于治疗恶性胸腔积液。临床实践表明，可明显减少胸水量，改善患者咳嗽、咳血、胸闷、胸痛、气促症状，提高生活质量，未发现明显不良反应。外用制剂患者多能耐受，使用方便［2-4］。我院欲将逐水巴布帖申报医院制剂，本试验采用薄层鉴别法（TLC）对甘遂、芫花和甘草3味药材进行定性鉴别，对测定巴布贴中芫花素含量采用HPLC定量测定，为其质量标准的制定提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪，数显恒温水浴锅（金控市科技仪器有限公司），KQ5200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：700W，频率：40kHz），Bp211D电子分析天平（德国），DHG-9070A型恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），硅胶G薄层板（10cm×10cm，青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药 逐水巴布贴（广东省第二中医院自制），所用药材（芫花、甘遂、水蛭、甘草、大戟）均由广东和翔制药有限公司购得，经鉴定符合《中国药典》2015版一部有关规定；芫花素对照品（批号：111899-201202）、芫花对照药材（批号：121062-201904）、甘遂对照药材（批号：121042-201605）、甘草对照药材（批号：120904-201620）均购于中国药品生物制品检定所；液相色谱流动相中的甲醇为色谱纯，其余均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

2.1.1 芫花 ①供试品溶液：取逐水巴布贴l片，剪碎后加甲醇25 mL，超声10 min，滤液蒸干，加乙醇2 mL使残渣溶解。②对照药材溶液：取芫花对照药材l g同法制得。③对照品溶液：取芫花素对照品2.15 mg，加甲醇制成每1.08 mg·mL-1对照品溶液。④阴性样品溶液：按逐水巴布贴工艺制得缺芫花的巴布贴膏体，取膏体5 g，按照供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液8 µL，对照药材溶液、对照品溶液各2 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶4∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

图1 芫花的薄层色谱图

2.1.2 甘遂 ①供试品溶液：取逐水巴布贴l片， 剪碎，加乙醇25 mL， 超声30 min，滤液蒸干，加乙醇2 mL使残渣溶解。②对照药材溶液：取甘遂对照药材l g，同法制得。③阴性样品溶液：按逐水巴布贴工艺制得缺芫花的巴布贴膏体，取膏体5 g，按照供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液8 µL，甘遂对照药材溶液2 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮（5∶1）为展开剂， 展开， 取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液， 在105℃加热至斑点显色淸晰。置紫外光灯（365 nm）下检视。

图2 甘遂的薄层色谱图

2.1.3 甘草 ①供试品溶液：取逐水巴布贴l片，剪碎，加甲醇50 mL， 加热回流1 h，滤液蒸干，加水40 mL使残渣溶解，加正丁醇20 mL萃取，重复3遍，合并正丁醇萃取液， 用蒸馏水洗涤3次， 弃去水层，正丁醇层蒸干，加甲醇5 mL使残渣溶解，得供试品溶液。②对照药材溶液：取甘草对照药材l g用100 mL水煮30 min，滤液浓缩至约30 mL，加正丁醇萃取，取正丁醇层蒸干，加甲醇5 mL使残渣溶解。③阴性样品溶液：按逐水巴布贴工艺制得缺芫花的巴布贴膏体，取膏体5 g，按照供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液8 µL，芫花对照药材溶液、对照品溶液各各2 µL，分别点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。

图3 甘草的薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；以甲醇-水-0.2%冰乙酸水溶液为流动相（65∶35∶0.8），检测波长235 nm；柱温30℃；流速 0.8 mL·min-1。

2.2.2 溶液的制备 ①对照品溶液：取芫花素对照品5.33 mg，加甲醇25 mL配成含芫花素213.2 µg·mL-1的对照品母液。将母液稀释至每1 mL含芫花素5、10、20、40、80 µg的对照品溶液。②供试品溶液：取逐水巴布贴，除去背衬，剪碎，取0.8 g，再精密加入甲醇5 mL，超声提取60 min，静置，用甲醇定容至刻度．滤过，取续滤液，即得。③阴性样品溶液：处方中除去芫花药材，按逐水巴布贴工艺制得缺芫花的巴布贴膏体，按照供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。

2.2.3 专属性考察 吸取上述对照品、供试品及阴性对照溶液各10 µL进行检测，结果显示，供试品、对照品中芫花素相应的保留时间无其他峰干扰，选择性良好，阴性无干扰。

2.2.4 标准曲线的绘制 母液稀释至系列浓度对照品溶液，精密吸取各浓度对照品溶液2 µL进样，测定峰面积，得回归方程：芫花素Y=85.459X-29.396（r=0.9997）。结果显示，芫花素在5.33～85.25 µg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取42.64 µg·mL-1芫花素对照品溶液，进样量10 µL，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果芫花素峰面积RSD为0.39%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，于配制后0，2，4，8，10，12 h进样测定，记录峰面积。结果芫花素峰面积RSD为0.85%（n=6），表明供试品溶液在制备后12 h内基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取逐水巴布贴6片，按“2.2.2”项下供试品溶液方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算含量。结果芫花素RSD为1.52%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取逐水巴布贴样品6份，每份约0.5g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密加入21.32、42.64、85.28 µg·mL-1三个浓度的芫花素对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果表明，芫花素平均回收率为99.69%，RSD为1.30%（n=6）。

表1 加样回收率试验结果

2.3 样品测定 取逐水巴布贴样品，按“2.2.2”项下方法制备溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果3批样品含芫花素分别为：92.4786、91.5531、92.1022µg·g-1，平均含量为 0.09204 mg·g-1。

表2 芫花素含量测定结果

3 讨论

在TLC检验时，甘草薄层鉴别按照药典需使用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，查阅文献亦有直接用硅胶G板做鉴别的报道［5］，尝试后发现斑点清晰无拖尾。同时摸索了红大戟的薄层鉴别，但没有明显斑点，红大戟中主要有效成分为蒽醌类化合物，难溶于水，指标成分经提取后有所损失，导致含量过低，无法鉴别［6］。最终选取甘遂、芫花、甘草作为薄层鉴别指标。

在含量测定时，处方中水蛭为君药，本应作为含量测定的指标成分，但因为水蛭含量测定的指标为抗凝血酶活性单位，但操作较复杂，不适合院内制剂批量生产检验［7-8］。其余药味中除甘草外，甘遂、芫花、红大戟均为有毒药材。甘遂具有治疗水肿，泻胸腹水的功效，指标成分大戟二烯醇属于三萜类化合物，分子量大，难溶于水［9］。芜花具有泻水逐饮，治疗水肿胀满的功效，指标成分芫花素属于黄酮类化合物［10］。红大戟属于3-羟基巴戟醌和芦西定属于蒽醌类化合物，在TLC检验时已无法鉴别。综合考虑，选择芫花素作为含量测定指标。

综上所述，本研究中甘遂、芫花、甘草的薄层鉴别和芫花素含量测定方法简便稳定，易于实现，可作为逐水巴布帖的质量控制指标。