P62基因对恶性黑色素瘤细胞侵袭的影响及机制研究

易娟娟，招玉玲，谢蒲辉，唐妍，黄惠珍，郑丽，蔡艳桃，杨竞，张晶，毛越苹

（1.佛山市妇幼保健院 皮肤科，广东 佛山 528000；2.中山大学孙逸仙纪念医院 皮肤科，广东 广州 510120）

恶性黑色素瘤发病率较低，但病死率非常高，主要是由于细胞生物恶性程度高，且极易侵袭、转移。因而探索恶性黑色素瘤的侵袭、转移机制显得尤为重要，有助于为临床靶点治疗提供新的理论依据。

P62是一个经典的自噬标志基因，其在调控细胞生长、凋亡等生理过程中发挥重要作用[1]。胰腺癌中，P62 与核转录因子NRF2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, NRF2）的激活可以诱导肿瘤细胞化疗耐受[2]。卵巢癌中，P62 的聚集可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶（cystine containing asparate specific protease-8, Caspase-8），从而促进卵巢癌的进展[3]。食管癌中，P62 蛋白受microRNA-487a 的靶击，从而促进食管癌细胞的增殖[4]。此外，P62 在乳腺癌中可以通过稳定癌基因MYC的信使RNA 从而维持肿瘤的干性特征，且P62 通过与波形蛋白Vimentin 相互作用促进乳腺癌转移[5-6]。另有报道，Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶VPS34 通过刺激P62 磷酸化参与乳腺癌的发生、发展[7]。上述报道表明，P62 在多种肿瘤的发生发展、生理功能中发挥着重要的作用。尽管如此，P62 在恶性黑色素瘤中的生理作用及机制尚未见报道。本课题组前期研究发现，P62 可以发挥促进黑色素瘤细胞增殖及诱导细胞周期转化的作用，P62 也参与黑色素瘤侵袭、转移的过程[8]。因此，本实验探讨P62 在黑色素瘤细胞迁移、侵袭中的作用及其具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人恶性黑色素瘤细胞株A375 细胞（购自上海生命科学研究院细胞资源中心，本实验室永久保存），DMEM 培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清（澳大利亚Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（澳大利亚Gibco 公司），Transwell 小室（美国Corning公司），结晶紫染色液（上海碧云天生物技术有限公司），二甲苯和中性树胶（广州鑫邦有限公司），OPTI-MEMI 培养液（澳大利亚Gibco 公司），日本尼康Ti-S 显微镜，干扰P62表达的siRNA（其序列为GCACAAAUUUGGUAAGUCA）及阴性对照siRNA（广州锐博有限公司）。Western blotting 抗体如下： 兔抗β-catenin、兔抗c-Jun，鼠抗ZEB1，兔抗Axin、兔抗TCF4、兔抗c-Myc、兔抗P62、兔抗GAPDH、兔抗CCND1、兔二抗、鼠二抗均购自美国Proteintech 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人恶性黑色素瘤A375 细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，37℃、5%二氧化碳CO2条件下传代培养。取处于70%对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 siRNA 转染转染前1 d，分别将细胞按1.0×105个/孔接种于6 孔板中，加入2 ml 含血清的高糖DMEM 培养基，37℃、5% CO2条件下培养至≥55%融合。将干扰P62基因表达的siRNA 和阴性对照siRNA 转染A375 细胞，分别作为干扰组和对照组。①分别取10μl/孔siRNA 溶液与无血清OPTI-MEMI培养基250μl/孔在2 ml EP 管中轻轻混匀（干扰组与对照组均设3 个复孔，干扰组： siRNA-P62 溶液30μl+无血清OPTI-MEMI 培养基750μl；对照组： 阴性对照溶液30μl+无血清OPTI-MEMI 培养基750μl）。分别取阳离子脂质体Lipofectamine 2000 转染试剂5μl/孔，与无血清OPTI-MEMI 培养基250μl/孔在另一个2 ml EP 管中轻轻混匀（干扰组与对照组均设3 个复孔，干扰组： Lipofectamine 2000 转染试剂15μl+无血清OPTI-MEMI 培养基750μl；对照组： Lipofectamine 2000 转染试剂15μl+无血清OPTIMEMI 培养基750μl），两组分别置于室温下孵育5 min。②将上述孵育后的siRNA 混合液分别与孵育后的Lipofectamine 2000 混合液（即上述Lipofectamine 2000 转染试剂+无血清OPTI-MEMI 培养基）轻轻混合，室温条件下孵育20 min 以形成转染混合物。③吸弃原6 孔板中的培养基，用PBS 洗2 遍，分别在每个孔中加入1.5 ml 新鲜含血清的高糖DMEM 培养基，将上述孵育后的混合液分别加入新DMEM 培养基的6孔板中。每组3个复孔。④将6孔板置于孵箱37℃、5%CO2条件下培养，6 h 后弃旧培养基，用无菌PBS 洗2 遍，换2 ml 含10%血清的DMEM 培养基。24 h 后行Transwell 实验，48 h 后行Western blotting 检测。

1.2.3 Transwell 实验转染24 h 后取6 孔板干扰组和对照组细胞（选取生长状态良好的转染后黑色素瘤A375 细胞）。0.25%胰酶消化细胞，终止消化后离心，用无血清培养基调整细胞密度至1×106个/ml（即每100μl 含1×105个细胞）。在配套的24 孔板加入500μl 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，将Transwell 小室放进24 孔中，确保没有气泡（每组设3 个复孔）。取无血清细胞悬液l00μl 加入Transwell小室的上室中，常规培养12 h（观察5 ～10 个细胞穿膜），终止培养。取出上室，将未穿膜的上室内细胞用湿棉签擦去，甲醇固定细胞30 min。移到500μl结晶紫染液的孔中染色15 min。蒸馏水冲洗，将小室风干，剪下小室膜，晾干，二甲苯和中性树胶（比例1 ∶1）封片。干燥后于正显微镜下随机选择5 个高倍视野拍照，计算穿过Transwell 小室膜的平均细胞数。

1.2.4 Western blotting取处于对数生长期转染后48 h 的干扰组及对照组细胞，用PBS 溶液洗涤细胞3 次，在冰上加入放射免疫沉淀测定裂解液+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂（比例100 ∶1 ∶1）裂解细胞，孵育30 min，使细胞完全裂解、离心。留取适量上清测蛋白浓度，以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取相同浓度的样品加入Loading buffer金属浴变性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶。在电泳槽中加入变性后的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V，30 min；100 V，120 min），之后电转移（350 mA，3 h）把目的蛋白从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，洗膜，孵育一抗（浓度1 ∶1 000）过夜。第2 天，洗膜，孵育鼠二抗或兔二抗（浓度1 ∶5 000），加入显色ECL 增强型化学发光酶反应底物，在化学发光仪上显示目的蛋白条带。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P62 对黑色素瘤细胞穿膜的影响

两组Transwell 实验结果见图1。干扰组的穿膜细胞数为（54.33±4.16）×109个；对照组穿膜细胞数为（126.70±4.04）×109个（见图2）。两组穿膜细胞数比较，经t检验，差异有统计学意义（t=21.620，P=0.000），干扰组穿膜细胞数低于对照组。

2.2 P62 对黑色素瘤A375 细胞Wnt/β-catenin及下游通路的影响

两组P62、ZEB1、β-catenin、TCF4、c-Myc、c-Jun及CCND1 蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），干扰组低于对照组。见表1和图3。

图1 两组Transwell 实验结果 （×200）

图2 两组Transwell 穿膜细胞数比较 （±s）

表1 两组Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相对表达量比较 （±s）

表1 两组Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 P62 ZEB1 β-catenin TCF4 c-Myc c-Jun CCND1干扰组 0.085±0.008 0.422±0.072 0.265±0.091 0.119±0.004 0.128±0.053 0.271±0.095 0.101±0.078对照组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 t 值 198.103 13.905 13.990 381.484 28.497 13.291 19.963 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 P62 对Wnt/β-catenin 及下游通路的影响

3 讨论

恶性黑色素瘤就诊时往往已处于晚期，其生物恶性程度高，易侵袭、转移，病情进展迅速，预后极差。关于恶性黑色素瘤的发生、发展机制报道较多，但仍不足以阐明其具体的发病进展过程。因此，探讨黑色素瘤的发病机制意义重大，有助于临床开发靶向治疗药物，改善黑色素瘤患者的总体预后。

P62 是一种经典的自噬标志物，参与多种细胞信号传导调控及自噬过程[1]，在细胞生长、凋亡等过程中发挥重要的生理功能。Wnt/β-catenin 通路在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生及其他生理过程中具有至关重要的作用；同时与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。如果这条信号通路被异常激活，就可能诱导癌症的发生、发展。P62 与Wnt/β-catenin相关通路在神经胶质瘤[9]、肝癌[10]、舌鳞癌[11]及卵巢癌[12]中的作用已有报道，然而在黑色素瘤中报道较少。

本课题组前期研究发现，P62可以促进恶性黑色素瘤细胞增殖及周期转化，表明P62在黑色素瘤中发挥癌基因的作用[8]。本研究结果显示，干扰P62 表达后黑色素瘤细胞的迁移、侵袭数目减少，与前期报道[9-12]一致，进一步支持P62 在黑色素瘤中发挥促癌因子的作用。

本研究进一步探讨P62 在黑色素瘤侵袭、转移过程中的具体机制。Western blotting 检测结果证实，干扰P62 表达后的Wnt/β-catenin 经典通路及下游相关因子（P62、β-catenin、TCF4、ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1）的表达均受抑制。TCF4 核转录因子是Wnt/β-catenin 经典通路的关键下游因子。当Wnt/β-catenin 通路被异常激活后，GSK3β/Axin/APC复合体降解β-catenin 受阻，导致胞浆内β-catenin大量蓄积，引起β-catenin 穿核与TCF4 结合，诱导下游因子ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1 等的大量表达，进而促进肿瘤细胞侵袭、转移。因而本研究提示P62在促进黑色素瘤侵袭、转移过程中发挥重要作用，其可能通过激活Wnt/β-catenin 相关通路及下游因子的表达促进细胞侵袭、转移。下一步的研究需要继续探索P62 调控Wnt/β-catenin 通路及下游相关因子表达的具体机制。

综上所述，P62 可能通过调控Wnt/β-catenin 相关通路及下游因子发挥促进黑色素瘤细胞侵袭、转移的作用。将来需要进一步研究P62 调控Wnt/β-catenin相关通路的具体机制。