食管鳞癌根治术患者组织中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表达与预后的相关性

张成伟，唱 宽，毛志刚，舒 建

(中国人民解放军北部战区空军医院心胸外科，辽宁 沈阳 110042)

由于环境污染、饮食习惯改变等多种因素，食管癌患病率攀升到恶性肿瘤第8位，不同的人种、地区食管癌类型有一定差别，在我国绝大部分患者为食管鳞癌(Esophageal squamous carcinoma，ESCC)[1,2]。与大多数恶性肿瘤相同，早期ESCC无明显临床症状，晚期患者5年生存率仅10%，临床治疗以手术为主，因此需要可预防ESCC转移和复发的治疗策略，进一步提高患者预后生存情况[3,4]。随着人们对免疫系统的深入研究，发现了程序性死亡分子配体1(Programmed death ligand 1，PD-L1)与其受体(PD-1)组成的信号通路对免疫细胞有调控作用[5]。本研究检测了免疫细胞CD8+/FOXP3+比值和PD-L1在ESCC组织中的表达情况，结合患者预后情况进行分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1临床资料：将2014年1月至2019年1月我院行ESCC根治术患者的存档蜡块和癌旁正常组织(距病变部位>5cm处，且证实为无癌浸润)石蜡标本各110例作为研究对象。癌与癌旁组织取样于男性92例，女性18例；年龄43～86岁，平均(73.64±6.09)岁。

1.2纳入及排除标准：纳入标准：①均行ESCC根治术；②无放化疗治疗史；③经术后细胞学及组织学病理确诊为ESCC，可以明确肿瘤大小、部位、浸润程度。排除标准：①经CT、MRI等影像学诊断无法确定TNM分期；②合并其他恶性肿瘤；③已诊断为远处转移；④伴随肺间质疾病或严重肝肾功能障碍；⑤患有血液系统疾病或传染病等。

1.3免疫组化：切取4μm厚石蜡组织切片，行常规HE复染确认。经烤片、脱蜡、水化后，进行抗原热修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭非特异性结合后，滴加一抗室温下孵育。TBST冲洗后滴加新鲜配制的DAB显色，2～3min后用自来水冲洗终止显色，苏木素复染，封固后于显微镜下观察。已知的PD-L1、CD8+、FOXP3+阳性标本为阳性对照。观察高倍(×400)视野下阳性细胞百分数及染色强度(见图1)，阳性细胞占比≤5%为0分、占比为6%～25%计1分、占比26%～50%计2分、占比51%～75%计3分、占比≥76%计4分；细胞未染色计0分、淡黄色为1分、棕黄为2分、棕褐为3分，总分=细胞染色评分×细胞占比评分，总分≥3分即为阳性表达。结果评判由2人进行双盲读片确定。

图1 ①ESCC组织中PD-L1阳性表达；②ESCC组织中FOXP3+阳性表达，细胞核染色；③ESCC组织中CD8+阳性表达，细胞膜染色

1.4观察指标：①比较CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC组织和癌旁正常组织中的阳性表达；②收集110例ESCC患者临床资料，分析年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、浸润、分化程度与CD8+/FOXP3+、PD-L1阳性表达的关系；③对110例ESCC根治术患者通过电话或门诊的形式随访，末次随访时间为2020年1月，统计患者生存情况，分析CD8+/FOXP3+、PD-L1表达与1年生存率的关系，无失访患者。

2 结 果

2.1CD8+/FOXP3+比值、PD-L1在ESCC组织和癌旁正常组织中的表达：CD8+/FOXP3+在ESCC组织中的阳性表达率低于癌旁组织，PD-L1在ESCC组织中的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

表1 ECD8+/FOXP3+ PD-L1在ESCC组织和癌旁正常组织中的表达

2.2CD8+/FOXP3+比值、PD-L1与ESCC临床病理参数间的关系：不同TNM分期、淋巴结转移情况、浸润程度、肿瘤直径和分化程度的ESCC组织中CD8+/FOXP3+、PD-L1的阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；但不同年龄、性别的ESCC组织中CD8+/FOXP3+比值、PD-L1 CD8+/FOXP3+表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 CD8+/FOXP3+比值 PD-L1与ESCC临床病理参数间的关系

2.3影响ESCC患者预后生存的单因素分析：110例行ESCC根治术患者1年总生存率为86.36%(95/110)，单因素分析显示，TNM分期T1～2期的患者1年生存率为高于T3期患者；合并淋巴结转移患者1年生存率低于未合并淋巴结转移患者；PD-L1阳性表达组患者1年生存率低于阴性表达组患者；CD8+/FOXP3+阳性表达组患者1年生存率高于阴性表达组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，不同年龄、性别、浸润程度、肿瘤直径的ESCC根治术患者生存率比较无差异(P>0.05)，见表3。

表3 影响ESCC患者预后生存的单因素分析

2.4影响ESCC患者预后生存的多因素分析：以ESCC患者术后1年生存情况为因变量，以上述有统计学意义项(TNM分期、淋巴结转移、PD-L1、CD8+/FOXP3+)作为自变量，对上述因素进行赋值，(TNM分期：T1～2期=1、T3期=0；淋巴结转移：无=1、有=0；PD-L1：阴性=1、阳性=0；CD8+/FOXP3+：阳性=1、阴性=0)，并将其纳入Logisitic回归模型中，发现TNM T3期分期、合并淋巴结转移、PD-L1阳性表达、CD8+/FOXP3+阴性表达是ESCC患者预后的独立影响因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响ESCC患者预后生存的多因素分析

3 讨 论

近年来环境污染加剧，人们饮食习惯改变，食管癌患病率逐年攀升，在我国绝大部分患者表现为ESCC，早期ESCC无明显临床症状，晚期患者5年生存率仅10%。ESCC的发病率逐年升高，根治性手术和术后辅助化疗是目前的主要治疗手段，ESCC因部位特殊性、肿瘤大小、分化程度等指标会影响根治性手术切除的效果和预后情况[6]。目前对行ESCC根治术患者预后的预测主要通过检测血清肿瘤标志物水平和明确TNM分期，但二者对ESCC患者预后的判断准确度较低[7]。因此，继续寻找新的生物学标志物对提高患者的术后治疗效果显得尤为必要。

PD-1/PD-L1通路在恶性肿瘤的发展中有负向调节作用，PD-L1作为一种跨膜蛋白，对免疫细胞有一定活化作用，可以帮助肿瘤细胞逃避免疫系统淋巴细胞的进攻，关嵩[8]等研究指出经免疫组化检测发现PD-L1在ESCC患者组织中的阳性表达率与性别、肿瘤分期、分化程度相关。又有研究指出PD-L1在ESCC组织中的阳性表达率远高于正常组织[9]。CD8+对肿瘤细胞的杀伤力在多项研究中被证实，通过分泌穿孔素和淋巴毒素等多种方式杀死肿瘤细胞；而FOXP3+基因突变会引发自身免疫缺陷疾病，阻碍淋巴细胞的调节功能；所以CD8+/FOXP3+比值的表达情况与自身免疫系统的功能相关，CD8+/FOXP3+表达越高，免疫系统在抗肿瘤过程中发挥的效用越高[10]。高翔[11]等的研究提示术前血清中性粒淋巴细胞比值与患者预后密切相关。本研究中，ESCC的TNM分期、淋巴结转移情况和浸润程度影响CD8+/FOXP3+和PD-L1的表达情况，肿瘤的直径、分化程度影响PD-L1表达，说明PD-L1和CD8+/FOXP3+的表达与多项临床病理参数都有关系，可能对患者的预后有影响。

本研究对比了患者预后生存情况，110例行ESCC根治术患者1年总生存率为86.36%(95/110)，单因素分析显示PD-L1阳性表达患者1年生存率低于阴性表达患者；CD8+/FOXP3+阳性表达患者1年生存率高于阴性表达患者，提示PD-L1阴性表达与CD8+/FOXP3+阳性表达对患者预后有正向影响，这与PD-L1激活后帮助肿瘤细胞进一步发展、FOXP3+阴性表达影响免疫系统的正常运作、CD8+阳性表达利于溶解肿瘤细胞的功能相关。多因素分析结果显示，TNM T3期分期、合并淋巴结转移、PD-L1阳性表达、CD8+/FOXP3+阴性表达是影响ESCC患者预后的独立危险因素，提示CD8+/FOXP3+阳性表达、PD-L1阴性表达、TNM分期为T3期、有淋巴结转移的行ESCC根治术的患者可能出现不良预后，应在临床治疗中重点观察。本研究亦存在不足之处，回顾性研究选例存在偏倚，有待日后扩大样本进行前瞻性研究，验证CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC患者体内的表达与其预后生存的关系。

综上所述，CD8+/FOXP3+阳性表达、PD-L1阴性表达、TNM分期为T3期、有淋巴结转移是影响ESCC根治术后患者预后的独立危险因素，可以为今后免疫治疗药物、患者术后治疗提供一定参考。