基于 TLR4/IL-1β信号通路探讨阿是穴刺血治疗痛风性关节炎疗效观察

左政，黄培冬，王馨悦，普勇斌

(1.云南中医药大学，昆明 650500;2.云南省中医医院，昆明 650021)

痛风性关节炎(GA)属于代谢风湿病的范畴，是因嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄减少、血尿酸持续升高而引起尿酸盐结晶(monosodium urate， MSU)析出并沉积于组织或器官而表现一组临床症候群的疾病[1]。GA常累及肾脏，引起慢性间质性肾炎和肾尿酸结石形成，临床表现为高尿酸血症、痛风性关节炎反复发作、痛风石沉积、特征性慢性关节炎和关节畸形。急性痛风性关节炎常为首发症状，疼痛剧烈、反复发作，如果没有对症治疗，病情进展后常因关节畸形引起活动功能障碍，甚至造成残疾，严重影响患者的生活质量和减少生存时间。近年来随着饮食结构的改善，高蛋白、高嘌呤食物摄入量的增加，痛风的发病率逐年增高[2]，预计在21世纪，痛风在我国将成为仅次于糖尿病的代谢性疾病[3]。因此，治疗和控制该病己成为全球公共卫生关注的热点。众多研究表明，Toll样受体4/白细胞介素1β(TLR4/IL-1β)信号通路在 GA的发生、发展中起着重要的作用，它与免疫应答、炎症反应关系密切，可作为治疗GA的新靶点[4-6]。前期临床观察表明，阿是穴刺血对 GA有较好的疗效，能有效控制本病发展[7]。在此基础上，本研究以GA患者为研究对象，采用细胞学、放射、生化等方法，探讨阿是穴刺血对 TLR4/IL-1β信号通路调控作用，揭示该疗法在调节GA免疫应答、阻止炎症反应的部分分子机制，现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

所有病例均为2017年10月至2018年12月在云南中医药大学附属医院及昆明仁德医院就诊的 GA患者，共80例。采用区组随机进行分组先区组(区组长度为10，80例受试者分为8个区组)，再随机分组(按就诊顺序依次编号，从随机数据表中某一位置开始连续取10个2位的随机数，随机数排出序号后，规定序号1～5为观察组，6～10为对照组)，每组40例。观察组中男33例，女 7例;年龄 24～53岁，平均(28±2)岁;病程1.1～8.7年，平均(1.9±1.7)年。对照组中男36例，女 4例;年龄 22～55岁，平均(27±2)岁;病程 1.3～9.3年，平均(2.0±1)年。两组患者性别、年龄、病程比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准

依据美国风湿病学会 1985年修订的 GA诊断标准[8]。①滑囊液中有特异性尿酸结晶。②痛风石经化学方法或偏振光显微镜镜检证实含尿酸结晶。③具备下列临床、实验室、X线征象等12条中的6条者，急性关节炎发作＞1次;炎性反应在1 d内达高峰;单关节炎发作;患病关节皮肤暗红色;第一跖趾关节疼痛肿胀;单侧发作累及第一跖趾关节;单侧发作累及跗骨关节;有可疑痛风石;高尿酸血症;X线摄片示关节非对称性肿胀;X线摄片示骨皮质下囊肿伴骨侵蚀;关节炎发作时关节液微生物培养阴性。上述①②③中，具备任何1项即可确定诊断。

1.3 纳入标准

①符合GA西医诊断标准;②实验室检查有高尿酸血症;③急性起病，发病在 7 d以内，有发热，1个或多个关节出现红、肿、热、痛的临床症状，体温＜38℃;④年龄20～55岁;⑤能够遵从医嘱坚持治疗者。

1.4 排除标准

①由慢性肾功能衰竭、肿瘤放化疗治疗等引起的继发性GA者;②伴有精神病、老年性痴呆、震颤麻痹、癫痫者;③刺血部位表皮严重损害不能施行刺血疗法者;④合并严重心、脑血管和造血系统等疾病者。

2 治疗方法

2.1 观察组

采用阿是穴刺血治疗。红肿最明显处即“阿是穴”，选取患病关节部位充盈、青紫或怒张的络脉或病变附近相关腧穴点刺放血。患者仰卧或坐位，裸露患病关节，行常规消毒，左手按压穴位两旁，使皮肤绷紧，右手拇、食、中三指持大号三棱针，用腕力迅速、准确地点刺1～3针。针刺深度约3 mm，然后迅速退出，左手同时放松，用抽气拔罐器抽吸血液及尿酸盐，以污血出尽为度，轻症约2～5 mL，重症5～10 mL。关节局部肿胀明显者，可再在患部散刺 1～3针，使炎性渗出物及尿酸盐排出。每周2次，连续3次为1个疗程，共治疗3个疗程后行相关检测，每个疗程期间间隔3 d。放血后用无菌棉球和低敏透气贴贴敷针孔处，嘱患者放血部位 24 h不沾水，24 h后摘掉棉球和透气贴。

2.2 对照组

先给双氯芬酸钠缓释胶囊(四川华新制药有限责任公司生产，国药准字号H19991402)，每次50 mg，每日2次。关节肿痛控制后改服苯溴马隆片(惠氏制药有限责任公司生产，国药准字号H109500039)，每次50 mg，每日1次。连续服药7 d为1个疗程，共服用6个疗程(6周)后行相关检测。

2.3 饮食干预

①急性发作期，患者有发热、关节肿痛时宜绝对卧床休息，避免过度活动;②治疗期间应禁食动物内脏，限制鱼类、禽类进食;③多饮碱性水以促进尿酸排泄。

3 治疗效果

3.1 观察指标

两组患者分别在治疗前后各抽取空腹静脉血15 mL于肝素钠抗凝管中，采血时间为早晨 8:00—9:00。流式细胞术检测外周血C反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)、尿酸(UA);RT-PCR检测外周血单个核细胞(PBMCs)TLR4及 IL-1β mRNA表达水平;ELISA法检测外周血清 IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)的水平。

3.2 疗效标准

参照《中药新药临床研究指导原则》[9]拟定。

临床治愈:患者关节疼痛、肿胀等症状消失，关节活动正常。

显效:患者关节疼痛、肿胀等症状消失，关节活动不受限。

有效:患者关节疼痛、肿胀等症状基本消除，关节活动轻度受限。

从上述教师们的期待的学校文化特征来看，似乎两种文化类型更为大家所期待和向往。一种是关心人与在乎人，和谐大家庭式的文化。另一种是能够支持和鼓励教师成长与成功的文化。当然，学校文化类型并不是优劣之分，而只有适合与不适合，适合的就是最好的，学校管理者也应当根据本校实际情况，营造适合的学校文化，让教师情绪劳动表现更恰当、更舒展。

无效:患者关节疼痛、肿胀等症状无明显减轻，关节活动受限无明显改善。

3.3 统计学方法

采用SPSS21.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 两组临床疗效比较

观察组总有效率为 87.5%，对照组为 77.5%，观察组优于对照组(P＜0.05)。详见表1。

表1 两组临床疗效比较 [例(%)]

3.4.2 两组治疗前后血清CRP、ESR、UA水平比较

两组治疗前CRP、ESR、UA比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。两组治疗后CRP、ESR、UA较治疗前显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05);观察组治疗后CRP、ESR低于对照组(P＜0.05);两组治疗后UA比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2 两组治疗前后血清CRP、ESR、UA水平比较 (±s)

表2 两组治疗前后血清CRP、ESR、UA水平比较 (±s)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05

组别 例数 时间 CRP(mg/L) ESR(mm/h) UA/(μmol/L)观察组 40 治疗前 28.6±12.2 38.3±1.6 562.14±64.12治疗后 18.5±13.11)2) 20.2±5.31)2) 423.55±63.16对照组 40 治疗前 27.9±13.6 37.6±2.7 542.75±67.14治疗后 24.2±2.61) 28.1±8.41) 431.17±60.841)

3.4.3 两组治疗前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表达比较

两组治疗前 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表达水平比较，差异无统计学意义(均P＞0.05)，具有可比性。两组治疗后 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表达水平较治疗前显著下降，差异均有统计学意义(P＜0.05);观察组治疗后 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表达水平低于对照组(P＜0.05)。详见表3。

3.4.4 两组治疗前后血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平比较

两组治疗前血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。两组治疗后血清 IL-1β、IL-6、IL-8水平较治疗前显著下降，差异均有统计学意义(P＜0.05);观察组治疗后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平低于对照组(P＜0.05)。详见表4。

表3 两组治疗前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表达比较(±s)

表3 两组治疗前后PBMCs TLR-4及IL-1β mRNA表达比较(±s)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05

组别 例数 时间 TLR-4 IL-1β观察组 40 治疗前 5.8±2.1 12.6±2.3治疗后 2.6±0.71)2) 4.4±2.11)2)对照组 40 治疗前 6.2±1.4 11.8±4.3治疗后 4.9±6.31) 7.2±5.21)

表4 两组治疗前后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平比较 (±s,pg/mL)

表4 两组治疗前后血清IL-1β、IL-6、IL-8水平比较 (±s,pg/mL)

注:与同组治疗前比较1)P＜0.05;与对照组比较2)P＜0.05

组别 例数 时间 IL-1β IL-6 IL-8观察组 40 治疗前 31.5±7.1 37.9±1.5 5.1±4.3治疗后 8.6±4.21)2) 24.4±2.11)2) 1.4±3.11)2)对照组 40 治疗前 30.6±5.2 38.7±4.3 5.7±1.2治疗后 13.4±1.31) 7.0±2.41) 3.5±2.41)

4 讨论

近年来研究发现，除代谢因素外，炎症与免疫也参与了痛风的发病，尤其是固有免疫在痛风急性炎症发生发展中发挥了重要作用[10]。Toll样受体(toll-1ike receptors， TLRs)是模式识别受体中的一种，广泛参与病原相关分子模式(pattern recognition receptors， PRRs)的识别及内源性危险信号相关分子模式(danger associated molecular patterns， DAMPs)的感知，产生相应的炎症及免疫应答反应。在抗感染免疫中首先被人们认识，它的重要作用在于信号的传递及炎症因子的产生[11]。在炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)的表面有TLRs分布。痛风的发病与尿酸盐晶体的沉积关系密切。研究表明，在尿酸钠结晶诱导的关节炎中，固有免疫发挥着重要的作用[12]。尿酸盐结晶通过TLRs组成的信号通路启动固有免疫应答，从而引发炎症反应。近年来有学者在痛风动物模型中研究发现，MSU可作为DAMPs激活TLRs，并产生免疫应答及炎症反应，从而促使痛风的发生发展[13]。

中医学认为痛风属“湿热痹”“历节病”范畴，主要是由于先天禀赋不足，脾肾功能失调，复因饮食不节、劳倦、七情等，使外邪痹阻于肢体经络，气血凝滞不通，湿浊流注关节而发病。目前，西医治疗GA主要有饮食控制、口服药物及手术治疗等方法，口服药物为常用方法，临床上急性期和慢性期用药各不相同，急性期一般采用秋水仙碱、非甾体类抗炎药及糖皮质激素等治疗，慢性期采用尿酸排泄药或抑制尿酸生成药治疗，药物治疗能缓解关节肿痛等症状，并能降低尿酸水平，但不良反应明显。刺血疗法属于针灸学的重要组成部分，是通过针刺放血，达到减轻或治愈疾病目的的一种疗法[13-14]。其作用原理在中医学中早有论述，如《素问·血气形态》:“凡治病必去其血。”《素问·针解》:“宛陈则除之，出恶血也。”《素问·调经论》:“病在脉，调之血，病在血，调之络。”该法操作简便，能迅速缓解关节肿痛，常常有立竿见影的疗效。

西医学认为刺血疗法主要是通过神经-血管-体液的调整，改善血液微循环状态和血液性状流速，通过促使血管内血栓转归及改善微循环障碍等方式来恢复机体对疼痛的自我调控能力。刺血疗法通过局部放血，使局部沉积的尿酸盐随血液排出体外，同时可以加速血液及淋巴循环，加快代谢产物的排泄[15]。刺血疗法能快速地减轻关节腔尿酸钠的沉积，减少炎细胞的浸润，改善关节软骨的超微结果，进而缓解局部症状[16]。刺血疗法能对腧穴形成慢性刺激反馈调节体内嘌呤代谢，促进尿尿酸的排泄同时抑制血尿酸的合成[17]。现代研究表明，刺络放血可以提高红细胞对机体的抗原-抗体复合物的免疫吸附力，使被黏附的免疫复合物中的细菌或病毒等容易被吞噬细胞吞噬，从而清除瘀积在血液循环中大量潜在的病原物质及致病性免疫复合物，提高机体的抗病能力[18-21]。

治疗后组间疗效比较，观察组总有效率明显优于对照组，表明阿是穴刺血治疗 GA有明显的优势;研究发现观察组治疗后CRP、ESR、IL-1β、IL-6、IL-8水平及 PBMCs TLR-4及 IL-1β mRNA的表达水平显著下降，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明阿是穴刺血疗法具有阻断或降低 TLRs样受体及信号通路上相关炎性因子的作用。其作用的机制可能是通过介导TLR4/IL-1β信号通路调控免疫应答、减少炎症细胞的浸润，改善局部组织坏死而发挥调节GA免疫应答、抗炎的作用。

综上所述，TLR4/IL-1β信号通路在GA的发生、发展中起着极其重要的作用。本研究结果表明，阿是穴刺血能介导TLR4/IL-1β信号通路调控GA患者免疫应答、减少炎症细胞的浸润，改善局部组织坏死。此结果为阿是穴刺血治疗 GA效应机制研究及临床应用提供了理论依据，丰富了中医针灸防治GA理论。但由于本研究为单中心研究，且研究时间及经费有限，本研究纳入的样本量相对较小，观察周期也较短，因此，试验的结论向外拓展受限。另外，由于阿是穴刺血操作的特殊性，本试验研究未实施盲法，因此，试验的结果客观性受限。在以后的研究过程中，可尽量使用盲法，以便提高研究质量。