果寡糖和益生菌及其组合对65～124 日龄猪生长性能、养分消化率和直肠微生物的影响

李 浩 ，周 波，夏中生，邹彩霞*，张 宁，黄伟杰，李 胜

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西农垦永新畜牧集团有限公司，广西南宁 530000；3.广西农垦永新畜牧集团格林饲料有限公司，广西贵港 537100；4.广西南宁大动保生物科技有限公司，广西南宁 530001）

在生猪养殖业中，通常在饲料中添加抗生素来促进生长和预防疾病，但由于抗生素的滥用加大了细菌耐药性和产品药物残留对消费者健康和生态环境的威胁。2019 农业农村部发布第194 号公告，决定自2020 年1 月1 日起正式禁止饲用促生长类抗生素，因此寻求抗生素替代品建立无抗饲粮成为研究者关注的焦点。Choi 等[1]和Pan 等[2]研究发现，益生菌和益生元可以改善肠道微生物区系、提高营养物质消化吸收和改善生长性能。

益生菌是活性微生物，当其量足够时可以给宿主的健康带来益处[3]。益生菌通过缓解肠道微生物紊乱，减少肠道致病菌，从而促进生长和提高饲料效率[4]、增加粪便中乳酸杆菌计数[5]等。研究发现芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌可防止断奶仔猪的大肠杆菌病，改善腹泻发病率和生长性能[6]。低聚果糖（Fructooligosaccharide，FOS）又称果寡糖，是益生元的一种。研究发现添加果寡糖可降低仔猪胃液pH，其通过调节肠道微生物群和发酵来改善猪胃肠道内的稳态[7]，改善生长性能[8-10]。但有关果寡糖、复合益生菌及其组合在生长育肥猪上的研究较少。本试验旨在研究在生长育肥猪饲粮中添加果寡糖、复合益生菌及两者组合替代抗生素对生长性能、养分消化率的影响，并探讨直肠细菌相对丰度和养分表观消化率的相关性，为其在生猪健康养殖上的运用和作用机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 果寡糖纯度30%（剩余70% 是麦芽糊精），为广西南宁某公司生产提供的“FOS30 粉剂”；益生菌为复合益生菌，含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis），有效活菌数1×109CFU/g，由盐城某公司生产提供“菌三宝”；抗生素为市售金霉素预混剂产品，含金霉素10%。

1.2 试验设计 选取健康、体重30 kg 保育期结束的杜×长× 大仔猪560 头，在饲养试验开始前，按体重相近原则随机分为5 组，每组4 个重复，每个重复28 头猪（公、母各半，置于1 个栏内），各组猪初始体重无显著差异。对照组饲喂基础日粮，金霉素组在基础日粮中添加0.10%金霉素制剂，果寡糖组在基础日粮中添加0.10%果寡糖，复合益生菌组在基础日粮中添加0.02%复合益生菌，合生元组在基础日粮中添加0.10%果寡糖和0.02%复合益生菌。

1.3 试验日粮与饲养管理 试验基础饲粮参照NRC（2012）猪营养需要配制饲粮，试验基础日粮由广西农垦集团金光畜牧有限公司提供，日粮组成及营养成分见表1。试验在广西农垦集团金光畜牧有限公司大塘猪场进行，预试期7 d，正试期60 d。自由采食和饮水，每日喂料2 次（08:00 和15:00），每次以吃饱后略有剩余为度（根据前1 d 的采食情况调整饲喂量），每天记录采食量和健康状况。

1.4 样品采集和分析测定

1.4.1 生长性能 分别于试验第0、20、40、60 天晨饲前称重；每天观察猪的采食情况，记录饲料饲喂的重量与剩料重量，并计算平均日增重和耗料增重比。计算公式：

平均日增重=（末重－初重）/饲喂天数

耗料增重比=饲养期内所耗标准饲料量（kg）/同期增重（kg）

1.4.2 内源指示剂法测定饲粮养分表观消化率 于饲养试验结束前6 d 晨饲前，每组随机选取12 头（每组4个重复，每个重复3 头），连续5 d 直肠取粪法采集约50 g 猪新鲜粪样，分成2 份，其中一份加5 mL 浓度为10%的硫酸混合均匀进行固氮，置于-20℃冷藏保存，用于测定养分表观消化率，另一份置于无菌10 mL 离心管内-80℃保存，用于测定直肠微生物。同时采集各组饲料样本，并将粪样、饲料样本带回实验室待分析，粪样、饲料样于65℃烘干至恒重，粉碎，过40 目筛后干燥保存用于测定营养成分。粗蛋白质采用全自动凯氏定氮仪（Vapodest 50s，德国 Gerhart）测定，粗纤维采用ANKOM200 半自动纤维测定仪（美国）测定，饲粮和粪中的粗灰分、有机物、干物质含量采用张丽英[11]方法进行测定。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.4.3 高通量测序测定直肠细菌 将-80℃保存的无菌10 mL 离心管内样品送至广西普斐信息科技有限公司测定直肠细菌组成。采用 Illumina HiSeq 测序平台利用双末端测序（Paired-End）的方法，构建小片段文库进行双末端测序。通过对Reads 拼接过滤，OTUs（Operational Taxonomic Units） 聚类，并进行物种注释及丰度分析，进一步进行α 多样性分析（Alpha Diversity），结合环境因素进行CCA/RDA 分析和多样性指数与环境因子的相关性分析。引物设计：选择V3+V4 区为测序区域，341F 和806R 引物序列分别为5´-CCTAYGGGRBGCASCAG-3´ 和5´-GGACTACNNG GGTATCTAAT-3´。

1.5 统计分析 试验数据由Excel 2010 整理后，由SPSS 19.0 进行统计分析，使用Duncan's 法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。直肠细菌测序数据使用PyNAST 软件（Version 1.2）与GreenGene 数据库中的“Core Set”数据信息进行快速多序列比对[12]，得到所有OTUs 代表序列的系统发育关系。最后对各样品的数据进行均一化处理，以数据量最少的样品为标准进行均一化处理，后续的Alpha 多样性分析是基于均一化处理后的数据，多样性指数组间差异分析分别应用Tukey 检验和wilcox 检验进行有参数检验和非参数检验。利用古生物统计学3.0 软件[13]和Spearman 秩相关系数检验[14]，分析养分表观消化率与细菌属水平物种相对丰度之间的关系。所得到的相关矩阵以热图格式可视化，并通过R软件（版本3.6.0）使用“correlate”软件包生成[15]。

2 结果与分析

2.1 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪日增重、采食量和耗料增重比的影响 由表2 可得，在65～84 日龄，果寡糖组耗料增重比显著低于对照组。在85～104 日龄，复合益生菌组的平均日增重和平均日采食量显著低于对照组。在105～124 日龄，各试验组平均日采食量和耗料增重比与对照组差异不显著，添加复合益生菌显著降低了平均日增重，其他试验组与对照组差异不显著。

2.2 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪养分表观消化率的影响 由表3 可知，与对照组相比，果寡糖组、复合益生菌组、合生元组均能显著提高饲料粗蛋白质、粗纤维、粗灰分、有机物和干物质的表观消化率，其中以复合益生菌组最佳。

2.3 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪直肠细菌组成的影响 如图1 所示，在对照组、金霉素组、果寡糖组、复合益生菌组、合生元组中Streptococcus和Lactobacillus的相对丰度分别占20.8%、16.4%、9.7%、10.6%、12.4% 和 15.0%、16.5%、20.0%、6.6%、8.7%；其余菌属中只有复合益生菌组的Megasphaera相对丰度大于5%，果寡糖组的Lactobacillus相对丰度含量最高为20.0%；RuminococcaceaeUCG-005 和RuminococcaceaeUCG-002 的相对丰度含量均高于对照组、金霉素组，Clostridium sensu stricto1 相对丰度在合生元组最高为5.2%，在果寡糖组最低为3.3%。不论是在对照组还是处理组，在被检出的 10 个主要菌属中Streptococcus和Lactobacillus是育肥猪直肠的主要优势细菌群。

表2 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪生长性能的影响

表3 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪养分表观消化率的影响

图1 添加果寡糖和益生菌及其组合对直肠细菌属水平物种相对丰度的影响

由图2 可知，Blautia、Ruminococcus gauvreauii group、Catenibacterium和Coprococcus3 与粗蛋白质表观消化率、粗纤维表观消化率、粗灰分表观消化率、有机物表观消化率和干物质表观消化率均为显著负相关。RuminococcaceaeUCG-002、Eubacterium coprostanoligenes group、RuminococcaceaeUCG-010、RikenellaceaeRC9gut group与粗蛋白质表观消化率、粗纤维表观消化率、粗灰分表观消化率、有机物表观消化率和干物质表观消化率均为显著正相关。

3 讨 论

3.1 添加果寡糖和益生菌及其组合对猪生长性能、养分表观消化率的影响 许多研究表明益生菌、益生元和合生元是良好的抗生素替代品[2,16-17]。董殿元等[18]研究发现添加0.35% 果寡糖对肥育猪后期（大于60 kg）的生长性能有显著影响。而张雷等[19]研究发现，0.04%果寡糖对育肥猪的生产性能改善不显著。本试验中果寡糖对生长性能的影响不显著，但可提高平均日增重、降低耗料增重比，研究结果的差异可能是果寡糖的添加量、猪日龄和日粮结构不同所致。本试验发现，饲喂益生菌对育肥猪生产性能的效果随着时间的推移逐渐增加；但合生元组效果略好于复合益生菌组；同时随着饲喂时间的增加，复合益生菌组和合生元组猪的生长性能显著好于其他组，这可能是肠道的益生菌不断增加而使得猪生长性能有所改善。

研究发现益生菌、益生元能改善仔猪肠道微生物群和肠道形态，增加养分消化率[7,20-21]。本试验中果寡糖组、复合益生菌组和合生元组能显著提高粗蛋白质、粗纤维、粗灰分、有机物和干物质的消化率，与Suryanarayana等[22]、谭聪灵等[23]、Lei 等[24]在生长猪日粮添加果寡糖增强了营养物质消化率的结果相似。可见果寡糖组、复合益生菌组和合生元组能通过改善生长育肥猪的肠道内环境，从而促进动物肠道健康，提高养分消化率。

3.2 添加果寡糖、益生菌及其组合对猪直肠细菌的影响由于粪便样本易于采集常被用作调查肠道微生物区系[25]。本试验在猪商品化养殖公司进行，受条件所限无法采集到其他肠道样品，因此，本试验仅采集直肠内容物。本试验中直肠内容物细菌组成测定结果显示，果寡糖组、复合益生菌组和合生元组中细菌物种数量以及Alpha 多样性均高于对照组和金霉素组，而对照组高于金霉素组，结果表明抗生素的使用降低了直肠细菌的相对丰度，与Knecht 等[26]研究发现抗生素的使用会降低肠道微生物的多样性的结果一致。Zhao 等[27]研究发现随着猪年龄的增加肠道微生物的Ace 指数、Chao 指数、Shannon指数和Simpson 指数显著增加，粪便中微生物的丰富度和均匀度在发育阶段是变化的。Zhang 等[28]研究发现金霉素组断奶仔猪盲肠特有OUT 高于对照组和罗伊氏乳杆菌组。本试验中对照组和复合益生菌组直肠细菌特有OTU 最高，与Zhang 等[28]的结果不一致，可能由动物日龄、环境和取样位置不同所致。

图2 猪直肠细菌属水平与养分表观消化率相关性

Streptococcus中不仅有许多致病细菌，而且有些链球菌可以产生乳酸（如乳酸乳球菌）。Whitehead 等[29]研究猪粪便微生物群时发现链球菌属、乳杆菌属和梭菌属是主要的细菌；这与本试验中链球菌属、乳杆菌属、巨型球菌属和梭菌属是直肠细菌属水平的主要细菌的结果类似。Clostridium、Ruminococcaceae等菌属在维持宿主机体健康方面具有至关重要的作用，被看作寄主不可缺少的功能生态系统服务提供者[30]。有研究发现，果寡糖通过选择性地促进乳酸杆菌菌群中某些种类的细菌增殖和富集[31]。试验中果寡糖组的Lactobacillus最高（20.0%），复合益生菌组最低（6.6%），而合生元组相对较低（8.7%）。这可能由于Lactobacillus能较好利用果寡糖，复合益生菌组的添加抑制Lactobacillus的生长，可以从合生元组的Lactobacillus高于复合益生菌组来解释，而这方面的研究尚未见报道。

Arumugam 等[32]研究发现拟杆菌对于碳水化合物的降解十分重要。本试验同样发现，Bacteroidees与粗纤维表观消化率呈显著正相关。Niu 等[33]研究发现，不同阶段的生长猪粗纤维消化率与11 属（Anaeroplasma、Campylobacter、Enterococcus、Clostridium、Methanob revibacter、Nitrosospira、Propionibacterium、Pseudobu tyrivibrio、Robinsoniella、Staphylococcus和Treponema）相关；在本试验中，属水平上有24 个属呈显著相关性。而关于猪肠道或直肠微生物与粗蛋白质、粗灰分、有机物和干物质表观消化率的相关性未见有报道。

4 结 论

本试验结果表明，饲粮中添加果寡糖以及果寡糖与益生菌合生元组制剂（合生元）替代抗生素能改善生长育肥猪的生长性能，而单独添加复合益生菌对生长性能有一定的负面影响，但统计分析差异不显著；试验中果寡糖组、复合益生菌组和合生元组通过改善直肠细菌区系、增加直肠细菌多样性，从而增加与养分消化率有关的细菌丰度，提高养分表观消化率。