硫代葡萄糖苷检测技术及其在花椰菜硫苷研究中的应用

鄂恒超 - 赵晓燕 - 张艳梅 - 周昌艳 -

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403)

硫代葡萄糖苷(glucosinolates，GSLs)简称硫苷，是一类广泛存在于双子叶被子植物根、茎、叶和种子中的次生代谢产物。根据硫苷中侧链基团的不同，可将硫苷分为脂肪类、芳香类和吲哚类硫苷3类180余种[1]。硫苷在芥子酶(myrosinase)、高温、强酸、强碱等条件下可发生降解，产生异硫氰酸酯类、腈类、硫氰酸酯类、环腈类(epithionitriles)、噁唑烷酮类化合物(Oxazolidine-2-thiones，OZTs)等物质[2-3]，进而产生抗癌、抗菌杀虫、改善风味等多种作用[4-5]。

花椰菜是中国重要的十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，是硫苷含量最为丰富的几种蔬菜之一[6]。花椰菜种植地域分布广泛，常见品种类型有白花菜、松花菜、青花菜以及罗马花椰菜等[7]。近年来，随着花椰菜新品种的不断选育，除产量和口感方面多样化外，总硫苷含量和种类也有着较大差异[8]，因此，高效准确完成硫苷的定性定量分析对花椰菜育种、营养评价以及硫苷类物质研究开发中至关重要。文章拟通过系统整理硫苷的检测方法，以及近10年花椰菜中硫苷检测新方法的应用，并对其未来发展方向进行展望，旨在为花椰菜中硫苷开发、育种以及营养评价等研究提供参考。

1 硫代葡萄糖苷分析方法

1.1 样品前处理

硫苷的化学性质相对稳定，但植物中黑芥子酶会使硫苷产生酶解反应，因此在硫苷提取过程中首先需要高温结合有机溶剂的方式进行黑芥子酶灭活处理。其次，在硫苷提取过程中，一般采用沸水、甲醇、乙醇和氯仿等作为提取溶剂。目前应用较广泛的溶剂为一定比例的甲醇—水溶液，提取方式主要有浸提、震荡、涡旋、超声等。Ares等[9]采用微波加热方式提取西兰花叶中硫苷，仅需3.5 min，是目前文献报道提取时间最短的方法。通过以上提取方法获得的硫苷类化合物粗提物含有较多杂质[10]，通常需净化处理。常用的净化方法包括萃取法和色谱法等。前者是基于硫苷在不同溶液中的溶解度差异达到富集硫苷的目的，后者则是利用硫苷特有的化学性质，选择合适的固定相和流动相，达到硫苷富集的目的。常用的固定相有DEAE Sephadex A-25树脂、酸性氧化铝、亲水键合填料、反相硅胶等[11]。此外，Szmigielska等[12]利用阴离子交换膜在油菜籽提取液中吸附硫苷类化合物，除4-hydroxyglucobrassicin外其余硫苷都具有较好的回收率。目前常用的样品前处理方法是将一定量的样品于75 ℃ 下预热后，加入预热至75 ℃(或沸腾)的70%甲醇—水溶液，75 ℃水浴提取10～30 min，浸提过程中震荡，离心收集上清，沉淀重复上述操作2～3次，合并上清液。提取液经DEAE Sephadex A-25树脂吸附处理后获得总硫苷。

1.2 硫苷定性定量检测方法

目前硫代葡萄糖苷的测定方法主要分为间接法和直接法(表1)[13]。间接测定法主要是利用GSLs在酶催化等降解过程中会产生硫酸盐、葡萄糖以及异硫氰酸酯等中间产物(图1)，通过定性定量检测这些产物，间接对硫苷进行定性定量；直接检测法不需破坏硫苷分子直接完成定性定量。

图1 硫苷降解过程及其产物[3]

表1 常用硫苷检测方法及其优缺点

1.2.1 硫苷间接分析法

(1) 硫酸根法：通过检测样品中GSLs降解后产生的硫酸根离子含量，间接测定样品中总硫苷含量，常用的方法包括BaSO4重量法[14]和滴定法[15]等。这两种方法都是利用BaSO4难溶的特点，在酶反应终止后加入过量的Ba2+盐，但重量法通过直接检测沉淀物重量计算总硫苷含量，而滴定法是通过检测剩余Ba2+含量计算总硫苷含量。该方法操作简单，使用试剂、设备较少，但该方法会受到酶活性和pH等因素影响，进而影响硫苷酶解程度，使结果的不稳定性增加，结果可信度不高。

(2) 葡萄糖残基检测法：葡萄糖残基检测法包括比色法和荧光检测法等[13]。比色法包括蒽酮比色法和3,5-二硝基水杨酸比色法等，其原理为显色试剂在一定条件下与硫苷降解产生的葡萄糖发生颜色反应，根据颜色深浅可比较准确地测定硫苷总量。比色法的优点是试剂易获取、操作简单；不足则在于玻璃器皿、净化树脂等对检测结果易产生干扰。Karcher等[16]利用硫苷降解得到的葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下得到葡萄糖酸(gluconic acid，GA)与7-氨基萘-1,3-二磺酸(7-aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid，ANDSA)反应生成荧光物质(GA-ANDSA)，进而通过荧光检测器检测推算硫苷的含量。该检测方法涉及酶降解、葡萄糖氧化、荧光物质生成等多个操作步骤，因此对试验人员要求较高，且易产生较大误差。该方法还包括双联酶极谱法[17]和电流安培酶法[18]等。

(3) 硫苷降解产生的异硫氰酸酯类(ITCs)、腈类(RCNs)、噁唑烷酮类化合物(OZTs)等产物也常用于定性定量分析样品中的硫苷。ITCs作为硫苷降解产物中的主要活性物质受到更多的关注。目前常用的ITCs检测方法包括光谱法、容量法和色谱法等[19-20]。如NY/T 1596—2008采用硫脲比色法测定油菜饼粕中异硫氰酸酯；此外还有利用紫外分光光度计直接测定有机溶剂(正己烷、乙醇)提取ITCs 在249 nm或243 nm处的吸光度值[21-22]、红外吸收光谱测定2 060～2 105 cm-1处的特征吸收值[23]，定性、定量分析ITCs。光谱法测定方法简单，所需时间短、灵敏度高，能完成定性和总量测定；银量法是容量法的一种，是中国测定菜籽饼粕中ITCs的国标方法之一(GB 13087—1991)，该法利用ITCs与氨水反应，生成相应的硫脲类化合物，然后再加入过量的硝酸银，生成不溶解的硫化银和碳化二亚胺，剩余的硝酸银用经典的伏尔哈德容量法测定。该方法时间长，操作复杂，但消耗较低，适用于定性和总量测定。除银量法外，容量法还包括直接滴定法和二乙胺滴定法等[20]；色谱法测定ITCs含量的方法包括气相色谱串联质谱法(GC-MS)和液相色谱串联质谱法(LC-MS)两种。GC-MS方法能对多组分的ITCs进行分析和鉴定，且操作简便，应用相对较多[24-25]。GC-MS方法也有一定的局限性，因为其不能测出受热易分解的吲哚类硫苷，对以吲哚类硫苷为主的十字花科植物测定结果偏低，另外花椰菜等样品自身会含有一定量的ITCs，通过测定酶解产物ITCs间接定量硫苷的方法会有一定的偏差。与GC-MS方法相比，LC-MS方法具有检测限低、分析时间短、分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠等优点[26]，但目前尚未见应用此方法通过测定ITCs间接定性定量分析GSLs的报道。

此外，通过测定硫酸酯酶水解产物间接定性定量分析硫苷化合物的方法也比较常见。国际标准化组织在1992 年颁布了ISO 9167-1：1992(E)推荐使用HPLC分析法，定性定量检测硫酸酯酶水解后的脱硫酸硫苷，间接测定硫苷类化合物的种类和含量。Olsen等[27]利用HPLC-MS/MS和NMR分析脱硫酸硫苷的方法，鉴定了豆蔻科中70余种硫苷化合物。

1.2.2 硫苷直接分析法 直接测定法不涉及衍生化和降解过程，既能大大减少降解环节产生的系统误差，又能排除样品内已有的降解产物干扰，提高方法的准确性。目前报道的直接测定法有麝香草酚法[15]、近红外光谱法[28-30]、胶束电动毛细管色谱法(MECC)[31]、高效液相色谱法(HPLC)、LC-MS等。

麝香草酚法在浓硫酸存在的条件下，与完整硫苷分子上的葡萄糖残基产生颜色反应，根据颜色深浅可比较准确地测定硫苷总量；近红外光谱法主要是通过已知标品建立红外分析模型，对比样品数据，快速测定硫苷含量。NY/T 3295—2018采用近红外光谱法测定油菜籽中硫苷含量；MECC法利用硫苷分子中含有硫酸酯基、吲哚基等官能团，能通过电泳的方式在硼酸盐缓冲体系中使硫苷达到分离的效果，从而达到定性定量分析样品中硫苷化合物的目的。

HPLC法可以更精确地鉴别硫苷，是目前应用最广泛的硫苷检测方法，其中超高效液相色谱(UPLC)具有快速、高分离度以及高灵敏度的优势，在含量较低成分的检测中具有很高的应用价值，受到广泛应用。HPLC联合紫外检测器(UV)或者二极管阵列(DAD)定性定量检测硫苷类化合物，能快速高效地完成样品的检测，具有较高的灵敏度[32-33]。随着质谱技术的快速发展，UPLC-MS/MS及UPLC-HRMS的联用技术越来越多地应用于硫苷检测中，目前已基于LC-MS技术开发出多种硫苷定性定量方法[34-39]，NY/T 3296—2018即采用液相色谱串联质谱法检测油菜籽中的硫苷化合物。

上述硫代葡萄糖苷检测方法各有优缺点(表1)。近红外反射谱法可以无损检测，虽然采样量少，但需大量标品去建立可信模型；荧光检测法检测步骤繁多，会导致检测结果误差增大；胶束电动毛细管电泳法干扰因素少，成本低，但分离时间长；气相色谱法无法检测出受热易分解的硫苷；高效液相色谱串联紫外检测法因可同时测定各种硫苷含量，重现性与精密度尚可，在实际应用中比较普遍，但该方法的检测限及其灵敏度较差，在硫苷或异硫氰酸酯含量较低的样品上存在方法应用的局限性；高效液相色谱串联质谱法因在硫苷检测中具备更低的检测限以及更高的灵敏度，受到越来越多的关注与应用，但在定性定量研究中需硫苷标准品，成本相对较高。

2 花椰菜中的硫苷分析

大量研究[32]证实花椰菜含有丰富的硫苷类化合物，在硫苷种类和含量方面均排在市售蔬菜的前列。不同品种的花椰菜中硫苷总含量差异较大，丁云花等[8]对3种类型15个花椰菜品种硫苷组分含量测定结果显示，其含量范围为0.332 3～4.872 8 μmol/g(FW)。花椰菜中已报道硫苷有50余个[40]，其中常见的有20个，包括脂肪类硫苷12个，芳香类硫苷4个，吲哚类硫苷4个，含量相对较大的为3-(甲基亚磺酰基)丙基硫苷(1)、4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷(2)、3-丁烯基硫苷(9)、3-吲哚基甲基硫苷(17)和1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷(18)等，这些硫苷的降解产物多具有抗肿瘤活性，其中4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷的酶解产物莱菔硫烷抗癌活性得到了广泛研究且取得了国际上的认可[41]。表2总结了近10年花椰菜中硫苷的定性定量分析方法，其中基于LC-MS的分析方法由于样品前处理简单、灵敏度高、定性定量方便等被广泛应用。高分辨质谱能提供准确的分子量信息，多用来进行定性分析；多级质谱因能选择特定离子进行碎裂片段分析，进而通过SIM、MRM等方式完成化合物定量分析，具有较高的灵敏度。花椰菜中常见硫苷及其在质谱中的MS/MS碎片信息，以及对应的降解产物相关信息见表3。

表3 花椰菜中常见硫苷及其对应的降解产物

表2 近10年花椰菜中硫苷的定性定量分析方法

3 总结与展望

目前，花椰菜中硫苷的分离、分析方法研究取得了很大的进展，但仍存在一些问题。① 检测技术方面，目前常用的色谱、质谱检测方法需购买硫苷标准品，但市场上的标准品价格较高且种类不齐全，使得检测成本相对较高。花椰菜中硫苷与异硫氰酸酯等降解产物是共存的，但迄今为止很多研究工作未同时考虑这两类化合物，导致对花椰菜中的硫苷营养成分评价不够全面。② 检测技术的不断创新要服务于花椰菜的生产加工。除花椰菜可食用部分外，其茎、叶中也含有大量的硫苷，但这些部位很多都以废弃物丢掉，未能得到更好的利用。基于以上不足，开发种类多样的硫苷化合物标准物质显得尤为必要。此外，开发同时分析硫苷和异硫氰酸酯等降解产物的分析方法，可有效地克服目前检测方法的不足；以及提高检测方法的灵敏度和检测限，缩短检测时间，提高检测效率和精确度等，均对花椰菜的品质评价，指导育种和产品开发具有重要意义。

续表3

类别化学式CAS号分子量质荷比[M-H]-质谱碎片降解产物(ITC等)化学式CAS号分子量5-(甲硫基)戊基硫苷C13H24NO9S329611-01-6435.52434.06434.06,354.11,259.01,195.03,128.93,96.96,74.995-(甲硫基)戊基异硫氰酸酯C7H13NS24430-42-6175.315-(甲基亚磺酰基)戊基硫苷C13H24NO10S3499-37-6451.50450.06450.06,435.03,386.06,192.03,96.96,74.995-(甲基亚磺酰基)戊基异硫氰酸酯C7H13NOS2646-23-1191.316-(甲基磺酰基)己基硫苷C14H27NO11S374542-18-0481.60480.07480.07,259.01,96.96,74.996-(甲基磺酰基)己基异硫氰酸酯C8H15NO2S2167963-03-3221.343-丁烯基硫苷C11H19NO9S219041-10-2373.39372.04372.04,259.01,195.03,130.03,96.96,74.993-丁烯基异硫氰酸酯C5H7NS34424-44-7113.182-羟基-3-丁烯基硫苷C11H19NO10S2585-95-5389.39388.04388.04,332.01,259.01,195.03,135.97,96.96,74.99告依春C5H7NOS1072-93-1129.184-戊烯基硫苷C12H21NO9S219041-10-2387.42386.06386.06,306.10,259.01,195.03,144.05,96.96,74.994-戊烯基异硫氰酸酯C6H9NS18060-79-2127.21黑芥子硫苷C10H17NO9S23952-98-5359.40358.03358.03,259.01,195.03,116.02,96.96,74.99烯丙基异硫氰酸酯C4H5NS200-309-299.15豆瓣菜苷C15H21NO9S2499-30-9423.45422.06422.06,358.02,259.01,195.03,96.96,74.99苯乙基异硫氰酸酯C9H9NS2257-09-2163.242(R)-羟基-2-苯乙基硫苷C15H21NO10S221087-78-5439.45438.05438.05,332.01,259.01,195.03,135.97,96.96,74.995-苯基-1,3-恶唑烷-2-硫酮C9H9NOS3433-15-6179.24苄基硫苷C14H19NO9S25115-71-9409.42408.04408.04,259.01,195.03,166.03,96.96,74.99苄基异硫氰酸酯C8H7NS622-78-6149.214-羟基苄基硫苷C14H19NO10S220196-67-2425.42424.04424.04,360.02,259.01,195.03,96.96,74.994-羟基苄基异硫氰酸酯C8H7NOS23763-98-6165.213-吲哚基甲基硫苷C16H20N2O9S24356-52-9448.46447.05447.05,367.10,259.01,195.03,121.95,96.96,74.99吲哚-3-甲醇C9H9NO700-06-1147.171-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷C17H22N2O10S25187-84-8478.49477.06477.06,446.05,259.01,96.96,74.991-甲氧基-吲哚-3-甲醇C10H11NO2110139-35-0177.204-羟基-3-吲哚基甲基硫苷C16H20N2O10S283327-20-2464.50463.05463.05,285.02,267.01,259.01,221.04,96.96,74.994-羟基-吲哚-3-甲醇C9H9NO281779-28-4163.174-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷C17H22N2O10S283327-21-3478.49477.06477.06,299.06,274.99,259.01,96.96,74.994-甲氧基-吲哚-3-甲醇C10H11NO296888-16-3177.20