植物乳杆菌M1-NTG300产细菌素培养条件优化

安 宇 王 颖,2WG ,2 易华西 - 张东杰ZHG -

(1. 黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2. 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；3. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000)

细菌素是某些细菌代谢时，经核糖体合成机制产生的多肽或前体多肽，抑菌活性较突出[1-2]。对同种近缘菌株呈狭窄活性抑制谱，常附着于敏感细胞特异性结合位点，通过抑制细胞生长代谢所必需的组分合成，致使敏感细胞死亡，从而起到抑菌效果[3-4]。现阶段，以乳酸链球菌素(Nisin)为代表天然防腐剂克服了生产上的诸多不足，以易消化和降解，使用无蓄积性毒害作用、零残留、遗传稳定性良好等特点，逐步成为研究者和消费者的关注热点[5-6]。

在微生物发酵工艺中，菌种的培养基组分是影响其菌种生长代谢和增殖的决定性因素[7-8]。对发酵条件的控制直接有利于开发菌株的发酵潜力，因此确定合适培养基配比和适合菌种生长增殖的发酵条件就显得重要[9]。除受菌株自身遗传学特质影响外，细菌素产量不仅对生长环境有限制和要求，某些类细菌素还需外围干预和诱导才能更好地分泌和蓄积[10]。其中生长环境多从培养基中氮源和碳源等功能成分的比例，或培养环境中各条件因素的均衡或特定配比考究，来完成目标物质的产生和释放。目前对菌株发酵培养条件的优化研究，主要集中在对培养环境(培养温度、时间、pH等)的优化[11-13]，以及对培养基营养成分中单一成分来源的优化研究[14-15]，而对培养基中多种营养成分的最优筛选及与刺激因子协同作用效果的研究仍较少报道。研究以课题组前期通过复合诱变法(微波—常压室温等离子体—亚硝基胍诱变)获得的在仍保持降胆固醇能力的基础上，可产细菌素的植物乳杆菌M1-NTG300为研究对象，拟通过对培养基中多种营养成分及刺激因子的筛选与组合，优化其发酵条件，以便提高细菌素的产量，为其应用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌M1-NTG300：实验室诱导分离保藏菌种；

指示菌：金黄色葡萄球菌、荧光假单胞杆菌，黑龙江八一农垦大学食品微生物实验室；

MRS培养基、LB培养基、蛋白胨：生化试剂(BR)，青岛海博生物技术有限公司；

葡萄糖、吐温80、氯化镁：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

电热恒温培养箱：DRP-9082型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；

生化培养箱：SHP-250型，赛多利斯科学仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：722型，赛多利斯科学仪器有限公司；

超净工作台：BCN-1360型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-75KBS型，上海申安医疗器械厂；

台式多管架离心机：TD5A型，北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 无细胞发酵上清液的制备 对出发菌株活化24 h以后，用2%的接菌浓度(108～109CFU/mL)接入MRS培养基中培养16 h后(37 ℃)，离心(8 000 r/min，5 min)，除去菌体，用NaOH(5 mol/L)调上清液pH至 6.0～6.5，过滤膜(0.22 μm)，得到无细胞发酵上清液。

1.3.2 抑菌活性的测定 加热指示菌固体培养基，待其融化冷却至45～50 ℃后倒板，平板凝固后将牛津杯平均分布于内。加热指示菌半固体培养基使其融化，冷却至45～50 ℃。稀释指示菌液浓度至10-2，在600 nm下检测发酵液的OD值。用移液枪吸取50 μL指示菌液接入指示菌半固体培养基中后倒板。在平板完全凝固时拔出牛津杯，并于孔中添加50 μL发酵液。在30 ℃条件下培养24 h，观察是否有抑菌圈生成[16-17]。游标卡尺测量抑菌圈的直径，采用Nisin效价标准曲线计算效价[18]。

1.3.3 单因素试验设计

(1) 碳源浓度的影响：选择葡萄糖作为培养基中的碳源，浓度分别为2%～4%等差分配，37 ℃培养24 h，以原MRS液体培养基平行对照。在葡萄糖浓度不同的MRS液体培养基中，接种M1-NTG300测抑菌性[19]。

(2) 氮源浓度的影响：选择蛋白胨作为培养基中的氮源，浓度分别为2%～4%等差分配，37 ℃培养24 h，以原MRS液体培养基平行对照。在蛋白胨浓度不同的MRS液体培养基中，接种M1-NTG300测抑菌性。

(3) 不同浓度刺激因子的影响：选择吐温80作为培养基中的刺激因子，浓度分别为0.20%～0.40%等差分配，37 ℃培养24 h，以原MRS液体培养基平行对照。在吐温80添加量不同的MRS液体培养基中，接种M1-NTG300测抑菌性。

(4) 金属离子浓度的影响：选择不同浓度MgCl2作为培养基中的金属离子，浓度分别为0.05%～0.25%等差分配，37 ℃培养24 h，以原MRS液体培养基平行对照，接种M1-NTG300测抑菌性。

1.3.4 响应面优化试验 根据单因素试验的结果，通过Box-Behnken进行响应面法的试验设计，对试验进行进一步的优化。

2 结果与分析

2.1 培养基组分单因素试验

2.1.1 碳源浓度对细菌素产量的影响 如图1所示，当葡萄糖浓度不同时，细菌素分泌量及抑菌活性的增加在一定范围内呈正相关，而随葡萄糖浓度的继续增大，细菌素效价和抑菌效果反而降低，分析原因可能是适宜浓度葡萄糖有利于细菌代谢繁殖，而外界葡萄糖浓度过高时渗透压升高，导致细菌渗透作用失水而发生质壁分离影响其生长[20]。综上，优选3.5%作为最佳葡萄糖浓度。

2.1.2 氮源浓度对细菌素产量的影响 如图2所示，细菌素效价及抑菌活性随蛋白胨浓度的增加一定范围内呈上升趋势。蛋白胨浓度为3.0%时，植物乳杆菌素效价和抑菌活性均较好。蛋白胨浓度大于3.0%时，细菌素随浓度增加小幅度下降。这可能是由于培养基中蛋白胨浓度或高，导致膜内外渗透压不同，细胞膜内水分进入营养液，导致细胞生长受影响[21]。综上，最佳蛋白胨浓度为3.0%。

图2 氮源对细菌素产量的影响

2.1.3 刺激因子添加量对细菌素产量的影响 如图3所示，细菌素效价及抑菌活性与吐温80浓度在一定范围内呈正相关，吐温80不仅能提高细胞膜的通透性，减少表面张力，还能促进营养物质透壁代谢，增多的营养类物质对产生细菌素具有正向促进作用[22]。吐温80浓度为0.30%时细菌素的产量最高，抑菌效果最显著。之后，细菌素效价和抑菌性随吐温80浓度增大反而迅速减小，吐温80浓度过高会造成细菌生长停滞甚至死亡[23]。综上，选择浓度为0.30%的吐温80为最佳刺激因子。

图3 刺激因子对细菌素产量的影响

2.1.4 金属离子浓度对细菌素产量的影响 由图4可知，随着MgCl2浓度的增加，植物乳杆菌素效价和抑菌活性呈先上升而后下降的趋势。当MgCl2添加量高达0.20% 时，细菌素的抑菌效果最佳，且效价最大。这可能是由于MgCl2对细菌细胞的结构稳定性起重要作用[24-25]，但MgCl2浓度过高会造成体系渗透压增大，而细菌调节体内Mg2+能力有限[26]。因此0.20% MgCl2可以作为优产细菌素的最佳浓度。

图4 金属离子对细菌素产量的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面因素水平设计 根据单因素试验结果，以植物乳杆菌素的效价为响应值，对葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、吐温80添加量和MgCl2浓度设计响应面试验，因素及水平见表1。

表1 响应面因素水平表

2.2.2 回归方程的建立与方差分析 采用Design-Expert 8.0.5.0软件中的Box-Behnken程序进行试验设计，结果见表2，方差分析结果见表3。对表2中的试验数据进行分析，得到的二次回归模型为：

表2 响应面法优化试验设计及结果

表3 回归模型显著性检验结果†

Y=0.58A+1.28B+0.46C-0.18D+1.02AB+0.82AC-1.72AD-1.50BC+3.32BD-3.10CD-2.47A2-3.80B2-2.62C2-4.48D2。

(1)

由表3可知，回归模型显著(P<0.05)，表明与实际情况拟合度好；模型的失拟项为0.598 8>0.05，表明在P=0.05水平上不显著，说明残差均由随机误差引起，对试验干扰小，证明试验的可靠性。预测值和真实值之间有较好的相关性，试验误差小，因此可用该方程对植物乳杆菌素效价进行预测。由F值可知，各因素对植物乳杆菌素效价影响大小先后顺序为：B(蛋白胨浓度)>A(葡萄糖浓度)>C(吐温80浓度)>D(MgCl2浓度)。

2.2.3 响应曲面交互作用分析 由图5可知，效价随因素值增大而升高，当达到曲面中心点极值时开始下降，蛋白胨浓度(B)和MgCl2浓度(D)及吐温80浓度(C)和MgCl2浓度(D)两量间交互作用所得到的响应面图曲面较陡峭，且等高线皆为椭圆形，表明BD、CD交互作用显著，与表3方差分析中显著性试验结果一致。表3方差分析表明其他4组交互作用均不显著。

图5 各因素交互作用对植物乳杆菌素效价影响的响应面及等高线图

2.2.4 模型验证实验 结合回归模型和响应面图分析得出植物乳杆菌素的最佳培养条件是：葡萄糖浓度为3.476%，蛋白胨浓度为3.391%，吐温80添加量为0.347%，MgCl2浓度为0.198%。考虑实际试验条件，确定最终植物乳杆菌素的培养条件葡萄糖浓度为3.5%，蛋白胨浓度为3.5%，吐温80添加量为0.35%，MgCl2浓度为0.20%，在此条件下经过5次重复性实验验证后得出，植物乳杆菌素的效价为(1 269.4±2.57) IU/mL。效价预测值与理论值1 270.5 IU/mL极接近，说明响应面分析所得的回归模型是可靠的。

3 结论

培养基组分单因素试验优化结果显示：植物乳杆菌M1-NTG300产细菌素的MRS培养基最佳组分为葡萄糖浓度3.5%、蛋白胨浓度3.0%、吐温80浓度0.30%、氯化镁浓度0.20%。在此基础上，采用Box-Behnken试验设计对其培养条件进行进一步优化，经验证，该模型合理可靠。通过模型分析并结合实际值进行修正后，得到的最佳培养条件为：葡萄糖浓度3.5%、蛋白胨浓度3.5%、吐温80浓度0.35%、氯化镁浓度0.20%，此条件下植物乳杆菌M1-NTG300所产细菌素的效价为1 269.4 IU/mL，与未进行培养条件优化前所产细菌素的效价(1 082.5 IU/mL)相比，提高了19.8%。有关研究[27-30]表明，细菌素的产量与细菌培养条件有关外，还受某些干预细菌素分析的诱导调控因素影响，因此后续试验将考虑从氨基酸诱导、最小初始接菌浓度及信号分子(肽类物质或者蛋白类物质)等方面对进行深入研究，从而更全面探析影响植物乳杆菌M1-NTG300产细菌素的因素。