电针“委中”穴对腰多裂肌损伤大鼠MC、HGF及相关因子影响*

李欣怡，许 玥，鲁 曼，张佳怡，陈 洁，陈 莉，徐 菁，白玉琢，陈玉佩，张 莉△，刘 通

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国中医药出版社，北京 100027；3.北京市昌平区南口医院，北京 102202； 4.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510095)

多裂肌是脊柱最内侧的椎旁肌,对抗脊柱过度旋转及滑动，维持脊柱稳定性影响腰痛。多裂肌损伤后局部微环境发生一系列变化，间充质干细胞(Mesenchyal Stem Cells,MSCs)可通过肌源性分化外机制——旁分泌作用促进骨骼肌再生修复。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)是MSCs旁分泌因子之一，作用于组织修复与再生。肥大细胞(Mast cell，MC)广泛分布于机体各个部位，受组织微环境影响终止分化，参与调节天然及适应性免疫反应[1]。然旁分泌因子HGF与MC的关系尚不明确。本研究拟复制大鼠多裂肌损伤模型，甲苯胺蓝法染色观察多裂肌周围肥大细胞变化，ELISA法检测多裂肌HGF及相关蛋白HGFA、c-Met受体的表达情况。从而观察造模后干预手段电针对损伤的多裂肌修复的影响，研究旁分泌HGF在多裂肌损伤修复过程中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠56只，体质量(300±20)g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。随机分笼饲养，自由饮食水，明暗周期12 h，环境温度24 ℃，湿度40%～50%，于动物房适应10 d饲养。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 布比卡因盐酸盐(美国Sigma公司，80-477-DK);10%水合氯醛(北京欧北生物科技有限公司，780379);4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技术有限公司，90090525);甲苯胺蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司，201900520)；大鼠肝细胞生长因子HGF酶联免疫试剂盒96T(上海酶联生物科技有限公司);大鼠肝细胞生长因子激活物HGFA酶联免疫试剂盒96T(上海酶联生物科技有限公司);大鼠原癌基因c-Met蛋白酶联免疫试剂盒96T(上海酶联生物科技有限公司，m1362210)。

1.2.2 主要仪器 半自动化石蜡切片机(德国莱卡仪器有限公司，RM2245);电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司);全自动组织脱水机(德国徕卡仪器有限公司，ASP300S);正置智能型显微镜及采集系统(奥林巴斯中国有限公司，BX53);韩式电针仪(北京思盛达医疗器械中心，HANS200A);标准规格酶标仪(赛默飞世尔科技公司，Multiskan MK3)；自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司，DEM-3)；电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，SKP-02.600)；离心机(美国sigma公司，3K18)。

1.3 分组与模型制备

56只大鼠采用完全随机法将其分空白组、模型组、电针组。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，背部备皮后选择L4～5水平脊柱双侧4点，使用一次性注射器紧贴脊柱进针，针达骨面回抽无血即注射，每点注射0.5%的布比卡因溶液100 μL，共400 μL，旋转针头拔出，操作过程保持无菌,模型制作完成。

1.4 干预方法

各电针组造模24 h后开始干预，将大鼠固定在操作台上，暴露背部和后肢，参照大鼠解剖图[2]和最新国家标准穴位图[3]，于大鼠膝关节背面正中取双侧干预。针刺前75%乙醇消毒，选用0.25 mm×13 mm华佗牌一次性针灸针垂直刺入委中穴表面皮肤约5 mm，针刺后连接韩式电针仪HANS-200A，2/100 Hz的疏密波，电流强度1 mA，持续干预20 min，1次/d。模型组与电针组同步抓取、固定，模型组不做其他处理。空白组不做任何干预。3组分别治疗后1 d、3 d和7 d同步取材(每时间点各6只)。腹腔麻醉选用10%水合氯醛(350 mg/kg)。大鼠深度麻醉后固定，充分暴露背部。剪开大鼠背部皮肤，以组织剪、镊子剥离腰部筋膜，于 L4～5两侧取下大鼠的腰部多裂肌，左侧置于-80 ℃冰箱保存，右侧置4%多聚甲醛溶液用于固定。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 甲苯胺蓝染色 观察腰多裂肌周围肥大细胞变化：分别于L4～5水平脊柱右侧取下大鼠腰部多裂肌(包含皮肤、皮下结缔组织)经4%多聚甲醛固定48 h后，使组织脱水机脱水，石蜡包埋，进行组织切片的制作，切片厚度为4 pm，切片方向为皮肤和肌肉组织块纵切面，随后将各部分进行脱蜡、脱氢和染色，采用0.5%甲苯胺蓝染色30 min，自来水冲洗，二甲苯透明，中性树胶封固。将甲苯胺蓝染色的切片置于自动化智能型正置研究级显微镜上进行图像拍摄，拍摄倍数为400倍。

1.5.2 酶联免疫吸附法(ELISA) 采用双抗体夹心ELISA方法检测HGF、HGFA和c-Met含量，参照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 腰多裂肌周围纵切面组织肥大细胞形态学变化

MC甲苯胺蓝染色结果示,3组镜下可见MC，呈圆形、椭卵圆形或不规则形，核小而圆，染色较深，细胞质内富含嗜碱性紫色颗粒，部分切片可观察到脱出于细胞质外的嗜碱性颗粒。3组中多裂肌MC细胞数量比多裂肌周围组织少。多裂肌周围组织切片中，模型组MC数及脱颗粒较其他两组明显。见图1～3。

图1 治疗1 d后大鼠腰多裂肌及皮下组织MC染色(甲苯胺蓝染色,400×)

图2 治疗3 d后大鼠腰多裂肌及皮下组织MC染色(甲苯胺蓝染色,400×)

图3 治疗7 d后大鼠腰多裂肌及皮下组织MC染色(甲苯胺蓝染色,400×)

2.2 ELISA测量HGF、HGFA和c-Met表达

2.2.1 3组大鼠腰多裂肌HGF表达比较 治疗后模型组、电针组多裂肌HGF表达与空白组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较治疗1 d、电针组腰多裂肌HGF表达高于模型组(P<0.01),电针组3 d和7 d多裂肌HGF表达与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠干预后多裂肌中HGF比较

2.2.2 3组大鼠腰多裂肌HGFA表达比较 治疗1 d后，模型组多裂肌HGFA表达高于空白组(P<0.01);电针组多裂肌HGFA 表达与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05);电针组多裂肌HGFA表达低于模型组(P<0.01)。治疗3 d后， 模型组、电针组与空白组3组之间多裂肌HGFA表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗7 d后，模型组多裂肌HGFA表达低于空白组(P<0.05);电针组多裂肌HGFA表达高于空白组(P<0.01);电针组多裂肌HGFA表达高于模型组(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠干预后多裂肌中HGFA比较

2.2.3 3组大鼠腰多裂肌c-Met表达比较 治疗1 d后，模型组多裂肌c-Met表达低于空白组(P<0.05);电针组多裂肌c-Met表达低于空白组(P<0.01);电针组多裂肌c-Met表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗3 d后，模型组多裂肌c-Met表达与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组多裂肌c-Met表达均高于空白组、模型组(P<0.01)。治疗7 d后，模型组多裂肌c-Met表达低于空白组(P<0.05);电针组多裂肌c-Met表达低于空白组(P<0.05);电针组多裂肌c-Met表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠干预后多裂肌中c-Met比较

3 讨论

多裂肌与腰椎紧密连接,腰部深层多裂肌萎缩和功能失调影响脊柱稳定性, 是慢性腰痛(chronic Low Back Pain, cLBP) 的发生、进展及复发的关键因素[4]。研究发现慢性腰痛患者深层多裂肌表面肌电信号时频异常[5],腰部多裂肌对L4～5节段稳定性的贡献高达2/3。前期大量研究发现电针“委中”穴可促相关炎症因子IL-10、生长因子VEGF、IGF、bFGF、Myod和自噬相关因子p-Akt、mTOR等表达[6-10]，进而实现多裂肌再生修复。但电针“委中”穴的旁分泌效应研究较少。“委中”穴位于足太阳膀胱经循行上，具有疏经活络、凉血解毒的作用，电针通过控制干预条件，观察“委中”穴远端腰部变化，阐释针刺对腰痛治疗的部分机理。故本研究电针“委中”穴干预损伤多裂肌大鼠模型，观察多裂肌HGF旁分泌因子及相关细胞、因子的动态变化。

肥大细胞(MC)是组织损伤微环境的关键组成部分，从炎症反应到重塑细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)[11]，参与所有步骤的组织修复。其中干细胞旁分泌因子——肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)对于组织损伤后修复再生至关重要[12]。

针刺对细胞外环境的改变是针刺效应产生的基础。研究证明电针直接刺激神经感受器启动信号,肥大细胞伴随脱颗粒[13]。肥大细胞(Mast cell，MC)广泛分布于全身结缔组织，尤以接受外来刺激较多部位的皮下、黏膜下等处居多[14]。吴美玲针刺大鼠“百会”“三阴交”“合谷”穴区，发现MC呈汇聚状态分布并伴随脱颗粒现象发生，脱出的物质聚集在周围且数量明显增多[15]。研究发现局部病灶MC聚集与疾病的发生程度成正相关，针灸可影响循经部位MC脱颗粒现象[16]。本研究通过电针”委中”穴观察多裂肌及周围组织肥大细胞变化,发现模型组肥大细胞及脱颗粒改变较其他两组明显，提示电针有抑制多裂肌损伤的可能。

HGF以无活性沉寂形式驻留在细胞外基质[17]，通过对不同细胞类型施加旁分泌作用影响微环境，实现组织保护、修复和再生。张安宁等发现电针骨骼肌钝挫伤大鼠健侧“足三里”及患侧阿是穴对应的健侧处，HGF蛋白表达量随时间升高，认为 HGF在电针干预骨骼肌损伤模型的早期已大量分泌[18]。本研究发现，腰多裂肌损伤大鼠治疗后1 d电针组HGF表达量高于模型组。电针组整体趋势均高于模型组，肯定了电针干预腰部多裂肌损伤大鼠后，HGF对骨胳肌修复的作用，且干预早期效果显著。

凝血因子XII样丝氨酸蛋白酶——肝细胞生长因子激活剂(Hepatocyte growth factor activation，HGFA)以无活性的酶原存在,发生组织损伤修复时被凝血酶等蛋白激活, 与Matriptase可剪切单链形式的前体HGF(Pro-HGF),使其转变成具有活性的异二聚体形式HGF，发挥HGF/c-Met信号通路活性[19-21]。本实验结果显示，模型早期腰多裂肌HGFA表达增多，7 d组出现较空白组表达减少，提示多裂肌损伤早期HGFA对环境反应敏感故被激活。治疗后1 d电针组HGFA表达低于模型组(P<0.01)，电针组3 d表达量较模型组增高，差异无统计学意义(P>0.05)，电针组7 d腰多裂肌HGFA表达量高于模型组(P<0.01)。电针组与模型组比较早期HGFA表达量少，干预后3 d开始升高，提示电针干预后期HGFA发挥激活HGF的作用,随时间激活作用越发显著。

HGF与特异性受体c-Met结合而被激活，整合生长、存活和迁移，促进组织重塑[22]。研究发现c-Met满足阑尾发育中成肌祖细胞的迁移, 同时也影响胸骨舌骨肌和后椎后肌再生[23]。常红梅等发现HGF变体NK4分子，由于其α链C末端丢失了16个氨基酸，导致NK4分子虽竞争性与c -Met结合，却不能激活受体[24]。本研究结果显示，治疗后1 d、7 d模型组c-Met均低于空白组(P<0.05)，提示多裂肌损伤致正常肌细胞减少，随之肌细胞表面受体通道减少，c-Met受体减少。治疗后1 d、7 d电针组c-Met表达低于模型组，治疗后3 d电针组高于模型组，提示电针干预后3 d肌卫星细胞表面的受体通道开放增加，随之肌卫星细胞表面的c-Met增加；坏死时间延长，多裂肌组织再生，随之肌卫星细胞减少，部分受体通道开始闭合，c-Met减少[25]。

目前针刺治疗腰痛效果得到一定认可，针刺作用机制研究尚未明确。研究发现干细胞移植促进大鼠损伤模型骨骼肌再生，但细胞并未分化为骨骼肌纤维[26]。因此通过肌源性分化以外机制——旁分泌作用，促进骨骼肌的再生得到重视。研究发现旁分泌活性多对心肌[27]、肾[28]、肝[29]和肺[30]的组织损伤具有治疗作用，但作为骨骼肌的多裂肌损伤研究较少。本实验旨在探求电针“委中”穴对于腰多裂肌损伤后修复的部分机制，观察MC、HGF及相关因子表达变化，结果发现电针降低多裂肌周围肥大细胞数及脱颗粒数，有抑制多裂肌损伤可能。肥大细胞脱颗粒使多裂肌周围环境改变，旁分泌因子HGF及肥大细胞同存于细胞外基质中，因而细胞外环境改变引起HGF被HGFA激活，后与c-Met受体结合，促进多裂肌损伤修复。但HGF的旁分泌作用机制仍需进一步探究。本实验开展为针刺作用机制研究提供思路。