电针对慢性应激抑郁大鼠中缝核脑区P11-tPA-BDNF通路的影响*

牟埈辉，王巧侠，罗 彤，赵 俊，赛音朝克图，李志刚△

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065)

抑郁症是一种以持续情绪低落为主要症状的精神情感障碍性疾病，具有高发病率、高复发率和高自杀率的特点[1]，给社会、个人和家庭带来巨大的损失和负担，近年来，抑郁症的发病逐渐呈年轻化趋势。目前为止，抑郁症的发病机制尚未明确，有效治疗率较低，近年来研究发现针刺疗法能缓解抑郁症患者焦虑、失眠、饮食和消化等方面的症状[2-3]，且这种疗法安全无副作用，能对病人有整体调节的作用。

关于抑郁症发病机制的假说很多，脑源性神经营养因子假说BDNF被认为与抑郁症的发生以及抗抑郁的治疗有极其重要的作用。既往关于BDNF的研究很多，研究其发生作用的通路较为分散，且研究主要集中在脑区的海马组织，对中缝核的研究较少，本实验通过观察中缝核组织中P11、tPA和BDNF的表达情况来对比观察电针对抑郁症的治疗作用，并试说明电针调控P11、tPA和BDNF发挥抗抑郁作用可能的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级SD雄性大鼠购自维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]，体质量170～190 g，饲养于北京中医药大学屏障环境动物室，空气流通，相对湿度60%，12 h昼夜循环光照。适应性饲养1周后，进行体质量测量和糖水实验评价行为学，选取符合条件的大鼠32只，应用随机数字表将大鼠分为正常组(C)、模型组(D)、药物组(M)和电针组(EA)4组，每组8只。C组大鼠群养，正常饲养28 d，不接受任何刺激。其余各组大鼠均单笼孤养并结合慢性轻度不可预见性刺激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)的方法进行抑郁造模。

1.2 实验试剂及仪器

1.2.1 实验试剂 盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司)；针具：0.30 mm×13 mm华佗牌无菌针灸针;PCR引物[生工生物工程(上海)有限公司];Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司);Real-time PCR扩增试剂盒(北京中原领先科技有限公司);DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);M-MLV反转录试剂盒(美国Promega);BDNF抗体(美国，Novus Biologicals，NBP1-46750);p11抗体(美国Novus Biologicals，NBP1-89370);tPA抗体(美国，Abcam，ab18987);CY3标记驴抗山羊IgG(武汉塞维尔生物科技有限公司，GB21404)。

1.2.2 仪器 HL202韩式电针仪:Real-Time PCR仪(美国 ABI 7500);激光共聚焦显微镜(日本Olympus,FV1000-LX81);4℃低温高速离心机(美国Thermo)。

1.3 模型制备

正常组动物不接受任何刺激和治疗，自由饮水，群养。其他3组均采用改良的慢性应激模型结合孤养，具体方法为：予7种不同的刺激，每日随机采取1种，但同种刺激不能连续出现且每种刺激至少3次；刺激方式分别为4 ℃冷水游泳5 min、昼夜颠倒24 h、禁食24 h、夹尾3 min、禁水24 h、笼位倾斜45° 24 h、潮湿环境24 h，共28 d。

1.4 实验干预

1.4.1 C组 动物群养，自由饮水进食，不接受任何刺激。

1.4.2 D组 大鼠孤养，接受28 d慢性应激造模处理。

1.4.3 EA组 在应激1 h后进行电针干预，参照《实验针灸学》[4]，平刺百会、印堂穴，深度均为0.5～1 cm，连接电针，电流1 mA，强度以大鼠头部微颤为宜，电针频率为2 Hz,每次留针30 min，1次/d，其他操作同模型组。

1.4.4 M组 在应激1 h后进行药物干预，将氟西汀用0.9%生理盐水配成1 mg/mL溶液，按2 mg/kg灌胃给药，1次/d，连续28 d，其他操作同模型组。

1.5 取材

实验的第28天，用20%乌拉坦(0.7 mL/100 g)对大鼠进行腹腔注射麻醉，迅速断头后，在超净台冰块上分离出中缝核组织，每组中的2只置于4%多聚甲醛中，其他置于灭菌的冻存管并放于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.6 观察指标

1.6.1 体质量检测 在实验前1 d和第28天分别进行体质量检测，计算并比较各组大鼠的体质量变化。

1.6.2 糖水消耗实验 实验前第1天和第28天,各组大鼠在禁水24 h后按1 g/40 mL给予1%蔗糖水，并测定1 d内大鼠蔗糖水的消耗量。

1.6.3 免疫荧光染色 中缝核组织经4%多聚甲醛4 ℃固定12 h，将固定组织取出自来水冲洗，脱水浸蜡，包埋，放入石蜡切片机切片，厚度为5～6 μm，切片置于-20 ℃保存，烤片后脱蜡复水，微波炉抗原修复20 min。染色步骤：切片热修复后，恢复至室温，PBS洗3次，每次5 min；滴加5% BSA封闭液，室温20 min，甩掉多余封闭液，滴加适当稀释的一抗(BDNF为1∶500；p11为1∶200；tPA为1∶200)，将切片放入湿盒内，4 ℃过夜；次日PBS(PH=7.4)冲洗3次，每次5 min；滴加荧光标记的二抗，室温30 min,PBS(PH=7.4)冲洗3次，每次5 min；DAPI封片。在激光共聚焦显微镜下观察3个指标在中缝核中的表达情况。

1.6.4 逆转录酶聚合酶链反应(PCR) 将组织从液氮中取出，放入预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨，破碎标本，采用Trizol法提取总RNA，经紫外分光光度计测RNA浓度。采用美国Promega公司的M-MLV反转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green法设计引物，P11受体的上游引物为5′-ATGGAGCATGCCATGGAAAC-3′，下游引物为5′-AACCCAGGGAACTCCCTTTC-3′，tPA受体的上游引物为5′-AGAGTGTGAGCTTTCTGGCT-3′，下游引物为5′-TGGACGGATACAGTCTGACG-3′，BDNF受体的上游引物为5′-TGCTGGATGAGGACCAGAAG-3′，下游引物为5′-TTCCTCCAGCAGAAAGAGCA-3′。Real-Time PCR反应程序为：①预变性：50 ℃孵化2 min，94 ℃预变性10 min；②PCR反应：94 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，45个循环；③溶解曲线生成：94 ℃预变性1 min，55 ℃退火1 min，55 ℃退火10 s，并以每循环增加0.5 ℃的温度进行80个循环；反应完成后软件自动计算出每个标本的循环阈值(Cycle threshold,Ct值)。用相对定量2-ΔΔCT法分析结果，mqookoop用各个样本的目的基因的Ct值﹣各个样本的看家基因(GAPDH)的Ct值，得到delta Ct；用delta Ct-对照组的大概均值，得到delta delta Ct(-ΔΔCT)。用2-ΔΔCT计算各个样本目的基因的表达变化。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 各组体质量检测比较

应激处理前，各组大鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05)。应激处理第28天，各组大鼠的体质量均有所增加，其中D组大鼠的体质量显著低于C组(P<0.01)，M组和EA组大鼠的体质量显著高于D组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化的比较

2.2 各组糖水消耗百分比比较

应激处理前，各组大鼠的糖水消耗百分比差异无统计学意义(P>0.05)。应激处理的第28天，D组大鼠的糖水消耗百分比要显著低于C组(P<0.01);M组和EA组的大鼠糖水消耗百分比显著高于D组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠糖水消耗百分比实验

2.3 各组免疫荧光染色结果

免疫荧光染色结果见于封三彩图1～3，为了对比电针治疗抑郁症的疗效，选取了D组和EA组的对比图。实验结果显示D组P11、tPA、BDNF 3个指标的阳性染色的细胞和染色强度明显低于C组，而M组和EA组3个指标在中缝核中的表达程度高于D组，这与PCR结果一致。

2.4 各组PCR结果

经28 d的实验干预后，经应激处理的各组大鼠中缝核组织中的BDNF、P11、tPA mRNA含量有不同程度的降低，其中D组较C组明显降低(P<0.05)，M组和EA组显著高于模型组(P<0.05)。而经电针和药物治疗后的大鼠海马组织中3种物质mRNA的含量与正常组比较差异无统计学意义，但仍低于正常组。见表3。

表3 各组大鼠中缝核组织中BDNF、P11、tPA mRNA含量比较

3 讨论

随着电子技术的发展，关于抑郁症的影像学研究也日趋丰富，大量研究表明，大脑前额叶皮质、海马、中缝核群是与情感、情绪和应激反应关系密切的脑区，其中海马和中缝核群有相互的纤维和功能联系。关于抑郁症的发病机制有很多假说，其中近年来关于细胞因子假说的研究较多。

脑源性神经营养因子(BDNF)具有保护神经元、促进神经元分化、增殖和再生的作用，并且与学习记忆功能相关，大量的研究证明各种原因导致脑内BDNF减少都会导致抑郁，BNDF的含量与抑郁症的严重程度呈负相关[5]。而且抗抑郁的药物是通过增加脑内BDNF的含量来提高突触的可塑性和促进神经元的生存来实现治疗抑郁症的效果的[6]。P11蛋白(又称S100A10)是S100EF手形蛋白家族的一员，在与抑郁症相关的脑区内广泛表达，如海马、中缝核等脑区[7]，参与胞吞、胞吐及细胞内外物质的转运，能调节抑郁样行为，并对抗抑郁药物的起效有重要作用[8]。研究发现抑郁模型小鼠脑内的P11的含量很低[9]，P11基因敲除后的小鼠出现严重的抑郁行为，且服用抗抑郁药物无效[10-12]，而P11过表达后能显著改善小鼠的抑郁行为，产生抗抑郁作用[9]。研究发现抑郁模型小鼠外周血白细胞P11 mRNA表达下降，在经抗抑郁治疗8周后其表达上调[13]。而P11过表达后能显著改善小鼠的抑郁行为产生抗抑郁作用[9]。组织纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, tPA)是脑内主要的纤溶酶原激活物，tPA在大脑皮质内广泛表达于海马、中缝核等不同脑区，与学习、记忆、精神紧张、突出可塑性和成瘾相关[14]。研究表明P11蛋白的C端氨基酸与tPA结合后启动并激发tPA的活性，tPA敲除后会产生抑郁样行为，而tPA过表达则会引起BDNF的表达上升[15]。因此本研究选择BDNF、P11和tPA作为检测指标，进一步探讨慢性应激抑郁模型大鼠的中缝核脑区，电针治疗抑郁症的可能机制及疗效。

大量研究证明，针刺对慢性应激模型大鼠的疗效显著，百会、印堂是抑郁症治疗的主要穴位[16]，能平肝潜阳、醒脑开窍、镇静安神，共奏调和阴阳之效。电针和传统针刺均有改善抑郁症状的特点，但对于首发性抑郁，电针见效时间更短、效果更快[17]。研究表明对百会、印堂电针治疗后能提高抑郁大鼠脑内BDNF的含量[18-19]，能改善抑郁大鼠的行为学[20]，对大鼠的体质量有良性调整作用[21]，在改善抑郁方面起效快、持续效应时间更长[22]

而PCR的结果显示模型组大鼠BDNF、P11、tPA的mRNA表达显著低于正常组，而经电针和药物治疗后大鼠的表达量要明显高于模型组。免疫荧光染色的结果与PCR结果相一致，在中缝核群里均有三者的表达，且阳性表达程度与PCR结果相一致。在实验开始的前1 d和实验的第28天分别对大鼠的体质量和行为学进行观察，体质量显示模型组大鼠的体质量较正常组明显下降，而经药物和电针治疗后的大鼠体质量较模型组有不同程度的升高。而在糖水偏好实验中可以看到模型组大鼠糖水消耗百分比较正常组显著减少，表现出明显抑郁症“快感缺失”症状。说明电针影响抑郁症的发生和治疗抑郁症的机制可能是通过P11-tPA-BDNF通路来发挥作用的。

与药物治疗抑郁症相比，电针干预后的各个指标虽在表达量上略高于药物，但差异无统计学意义，后续研究中可以考虑适当增加样本量来研究差异是否有统计学意义。