自噬相关蛋白MAP1LC3B在结肠癌中表达及其临床意义的初步探讨*

吴跃锐，朱杰文，吴建萍，黎宝珍

暨南大学附属顺德医院普外一科 广东佛山528303

随着诊疗程序的普及和完善，结肠癌患者的死亡率大幅度下降。同时，结肠癌的治疗在应用现有综合治疗方案的基础上，还更追求于精准的治疗方法以延长患者的生命、改善预后。因此，逐渐成熟的靶向治疗为其提供了新的思路。在寻找合适治疗靶点的研究中，自噬可作为供考虑的方向之一。自噬是结肠癌的肿瘤特征之一，它借助于溶酶体降解异常的蛋白和衰亡/衰竭的细胞器，从而具有维持细胞内环境稳定的功能。但是，其过度激活后可以引起Ⅱ型的程序性死亡[1]。微管相关蛋白1A/1B轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，MAP1LC3B）是调节自噬活性和鉴定自噬水平的关键基因，是自噬体模型的标志物，其水平的高低反映出细胞自噬活性的强弱[2]。但自噬相关蛋白MAP1LC3B是否介导了结肠癌患者早期肝转移、淋巴结转移的发生，以及自噬活性的强弱与结肠癌的恶性生物学行为的关系如何，目前尚无明确研究报道。本研究拟探讨MAP1LC3B在结肠癌中的表达以及它与结肠癌发生发展的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究采用回顾性研究方法，对2018年1月至2020年6月在本院接受手术治疗的结肠癌患者癌组织标本40例及癌旁正常组织标本40例（术中取材位置距离癌灶3 cm以上，并经病理诊断为正常结肠黏膜组织）进行分析。本研究经医院伦理委员会批准，患者知晓临床治疗方案及本研究内容。术中取材符合免疫组化实验相关要求，排除多原发癌患者组织标本。其中，男性21例，女性19例；年龄40～90岁，平均（61.2±8.1）岁；TNM分期（基于2016年UICC公布的第八版结肠肿瘤的TNM分期标准）：Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期3例，Ⅳ期32例。

1.2 免疫组化方法（immunohistochemistry，IHC）

组织常规包埋和切片，切片厚度为4～5 μm，采用Envision二步法进行检测，常规在3缸二甲苯中脱蜡各5 min，并分别放置在75%、90%、98%的梯度酒精中脱水，使用柠檬酸修复液，在高压锅中进行抗原修复3 min，使用3%的过氧化氢孵育，在微波炉中低温浸泡10 min，进行内源性过氧化物酶的修复，PBS冲洗3次后，滴加兔抗人MAP1LC3B多克隆抗体（1:100）【安诺伦（北京）生物科技有限公司，APR08313G】，在低温下过夜孵育，随后取出经PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，滴加HRP标志的广谱二抗（100 μL，1:200）进行继续孵育，30 min后行DAB显色，显微镜下观察染色效果。若能观察到组织呈棕褐色，表明为阳性反应，则迅速置于自来水终止染色，苏木素复染和中性树胶封片。

1.3 结果判断

由两名病理科医师彼此独立进行判断免疫组化结果判读。MAP1LC3B定位于细胞浆或细胞核，随机选取10个高倍镜视野，每个视野观察100个细胞，采用半定量评分方法。阳性细胞数：阴性为0，阳性细胞数小于10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，大于75%为4分。颜色强度：不着色为0分、淡黄色为1分、黄色为2分、棕褐色为3分。将阳性细胞数与颜色强度得分相乘得出分数，总分大于4分定义为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用（n）表示，组间采用χ2检验或校正χ2检验进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAP1LC3B的表达

MAP1LC3B在结肠癌组织中的阳性表达率为72.5%（29/40），癌旁正常组织中为30%（12/40），组间比较差异有统计学意义（χ2=14.459，P＜0.001）。MAP1LC3B在癌组织与癌旁正常组织中的表达见图1、图2。

图1 MAP1LC3B的阳性表达（IHC，×200）

图2 MAP1LC3B的阴性表达（IHC，×200）

2.2 MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达与患者临床病理参数的关系

MAP1LC3B在结肠癌组织中阳性表达组的肝转移发生率、淋巴结转移发生率高于阴性组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两组TNM分期、分化程度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达与患者临床病理参数的关系 n

3 讨论

随着医疗技术和人们对疾病认识的不断提高，结肠癌的诊疗水平有所提升，但是关于结肠癌的发生发展还有诸多问题需要阐明[3]。深入探讨结肠癌的发病机制，为临床治疗提供可能的分子靶点，对改善患者预后将具有重要的临床意义。

自噬是通过溶酶体溶解衰老细胞器，并且使底物重新循环利用，维持细胞内环境稳定的过程。过度的自噬活性可以启动Ⅱ型的程序性死亡，是机体衰老的细胞进行淘汰和清理病原体的一种途径。有学者将自噬作为一种新的研究思路，探讨它与肿瘤的增殖、凋亡和疾病转归的关系，发现通过调控自噬水平可以影响病情的发展，甚至有效杀伤肿瘤细胞[4]。研究发现，自噬的生物进化过程高度保守，无论是在酵母还是人体中，自噬相关的基因存在高度的同源性，自噬已经成为了令人感兴趣的靶向治疗研究方向，但临床治疗中关于是诱导自噬还是抑制自噬对癌症治疗更有益处仍存在争议[5]。自噬通路和诸多蛋白相关，其中MAP1LC3B是常见的信号蛋白，自噬系统的缺陷会导致肿瘤在不同器官中发生[6]。

MAP1LC3B参与了自噬体的形成，在自噬体的形成和半融合的过程中均发挥了重要的作用[7]，它可以组合自噬体膜的Atg8p，参与肿瘤相关基因转录后的修饰，与恶性肿瘤发生发展过程有密切的关系[8]。本研究检测了40例结肠癌组织中MAP1LC3B的表达情况，结果显示，MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达阳性率为72.5%，高于癌旁正常组织，提示MAP1LC3B的表达可能与结肠癌的发展有关。MAP1LC3B的表达量与自噬体的形成有关，且MAP1LC3B调控的自噬分子作用机制在肠癌侵袭转移中有重要的作用[9]，自噬活性可促进病情进展[9-10]。在本研究对MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达与患者临床病理参数的分析中，也发现MAP1LC3B阳性表达组肝转移发生率、淋巴结转移发生率较阴性组高。但本研究结果提示MAP1LC3B表达水平与TNM分期、分化程度无关，这或受到纳入病例TNM分期均衡性较低所带来的影响。此外，本研究纳入样本量较小，样本量来源单一，仅分析了数个临床病理参数的内容，所得结果仍需进一步探讨。

基于本研究，自噬相关蛋白MAP1LC3B在结肠癌组织中的表达高于癌旁正常组织，与结肠癌肝转移和淋巴结转移有关。但需要开展设计更完善、样本量更大的研究深入分析。