响应曲面法模拟优化细菌降解光-氧氧化褐煤工艺条件*

李建涛 刘向荣 杨 杰 庄肃凯

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，726000 陕西商洛；2.陕西省尾矿综合利用重点实验室，726000 陕西商洛；3.西安科技大学化学与化工学院，710054 西安)

0 引 言

褐煤在空气中容易风化，燃烧时对空气污染严重，但随着优质煤逐渐被采空，褐煤已成为我国主要使用的煤种之一。因此，减少褐煤利用过程中产生的环境污染，实现褐煤的高效清洁利用刻不容缓[1-3]。褐煤转化利用的途径主要有：气化、液化、热解和微生物降解等。其中，褐煤的气化、液化和热解技术成熟，但由于这几种转化技术需要高温、高压等苛刻条件，存在能耗高、对设备要求高等不足，人们渴望寻求一种工艺条件温和、能耗低、对设备要求简单的褐煤转化利用技术[4-5]。20世纪80年代， FAKOUSSA[6]和COHEN et al[7]相继报道了假单胞菌和白腐菌能够降解煤，这一实验事实引起了各国研究者的极大兴趣，煤的微生物降解作为煤清洁高效利用的新技术成为研究热点。细菌是煤降解过程中的主要作用菌之一，研究优化其降解煤的工艺条件至关重要。

响应曲面法(RSM)通过数学统计方法设计实验、建立模型、评估实验因素效果并寻求最优化工艺参数，是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法[8]。该方法实验设计合理，能以较少的实验数量和更经济的方式对实验进行全面研究，可以快速有效地确定多因子系统的最佳条件，广泛地应用于各类条件优化实践中，并取得了满意的结果[9]。但响应曲面法优化煤的微生物降解工艺方面的报道较为鲜见。占迪等[10]采用Box-Behnken设计，通过响应曲面法优化，得出了混合微生物菌群转化褐煤产甲烷的最佳工艺及各条件对甲烷产量影响的显著性。贾建军等[11]通过曲面响应法对热带假丝酵母溶煤的培养基进行了优化研究，得出了培养基的最佳配方。王静[12]采用响应曲面法对多黏类芽孢杆菌降解硝酸氧化宝鸡长焰煤的工艺条件进行了优化。可见，响应曲面法是微生物降解煤工艺参数和培养基组成等方面行之有效的优化方法。

煤的氧化预处理有利于微生物对煤的降解，常用的方法有硝酸氧化法、双氧水氧化法、臭氧氧化法、高温空气氧化法和光-氧氧化法等[13-14]。其中光-氧氧化法由于对煤原有结构破坏程度小、氧化效率高、可操作性强、污染小等优点，近年来有了长足的发展[15-16]。

前期菌-煤匹配实验筛选出降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的细菌优势菌株为恶臭假单胞菌，单因素实验确定的较优工艺条件为：加煤量0.3 g/20 mL，接种量2.0 mL/20 mL，降解时间12 d，培养箱振荡频率160 r/min，煤样粒度0.150 mm～0.075 mm，降解温度30 ℃。在此基础上，利用响应曲面法对优势菌株恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的降解工艺进行建模和优化研究，旨在得出可靠的预测模型和最佳降解工艺条件，为褐煤的微生物高效转化利用提供一定的技术参考。

1 实验部分

1.1 煤样

实验所用煤样为内蒙胜利褐煤(SLH)。煤样在60 ℃条件下，烘干3 h，经破碎、粉磨、筛分得到粒度为0.150 mm～0.075 mm的煤样。然后，利用自行设计加工的旋转床光化学反应器[17]对煤样进行光-氧氧化预处理，预处理条件为：加煤量20 g，煤样粒度0.150 mm～0.075 mm，紫外光强度150 W，马达转速120 r/min，氧化时间42 h，通氧时间40 min[18]得到光-氧氧化内蒙胜利褐煤(GSLH)。褐煤及光-氧氧化褐煤的工业分析和元素分析结果见表1。

表1 煤样的工业分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of samples

1.2 菌株及复壮

1.2.1 菌株及培养基

本实验所用细菌菌株为前期菌-煤匹配实验筛选的优势菌株恶臭假单胞菌(pseudomonasputida，PSP)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。培养基为LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.4～7.6，固体培养基加15 g琼脂。

1.2.2 菌株的活化及复壮

将斜面保藏的恶臭假单胞菌(PSP)接种至装有10 mL LB液体培养基的试管，将试管放入恒温振荡培养箱，在温度为30 ℃，振荡频率为160 r/min的条件下，培养2 d。然后在预先倒好的LB培养基平板上划线，倒置于人工气候培养箱，在温度为30 ℃，相对湿度为80%条件下，培养2 d，观察无杂菌后，用接种针挑少量菌体放入装有50 mL无菌水和玻璃珠的锥形瓶中充分振荡，用接种环蘸取一孔接种于装有10 mL LB液体培养基的试管中，将试管放入恒温振荡培养箱，在30 ℃、振荡频率为160 r/min条件下，培养2 d后，用接种环蘸取一孔接种至装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱，相同条件培养2 d，所得恶臭假单胞菌菌液作为实验母菌液。

1.3 降解实验

取试管若干，每个试管中装LB液体培养基20 mL，做恶臭假单胞菌(PSP)对光-氧氧化内蒙胜利褐煤(GSLH)的降解实验，设置三组平行实验。每只试管分别用移液枪量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL复壮好的恶臭假单胞菌(PSP)母菌液接种，放入恒温振荡培养箱，温度为30 ℃，振荡频率为160 r/min，培养2 d，接种的培养基变浑浊。分别加入0.20 g，0.30 g，0.40 g粒度为0.150 mm～0.075 mm经预处理的煤样，放入恒温培养箱，分别继续振荡培养6 d，12 d和18 d后，三组平行实验的降解产物分别离心(10 000 r/min，10 min)，上清液过滤，滤液再过0.22 μm微孔滤膜，以去离子水为参比，在分光光度计上检测滤液在450 nm处的吸光度，求得三组平行实验的A450平均值，以此作为指标评价恶臭假单胞菌对光-氧氧化内蒙胜利褐煤的降解效果[19-20]。

1.4 响应面实验设计

在前期单因素实验结果的基础上，对恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤(GSLH)效果影响较大的工艺条件(加煤量、接种量和降解时间，分别记为A，B和C)进行响应面优化研究，其他条件选取单因素实验确定的较优值。利用Box-Behnken设计法进行实验设计，以A，B和C为自变量，降解液在450 nm处的吸光度A450为响应值，表示为Y(A450)，进行响应面优化研究，最终得出最佳工艺条件及响应值Y(A450)与工艺条件取值之间的关系模型方程。实验方案设计见表2。

表2 Box-Behnken响应面设计Table 2 Response surface design by Box-Behnken method

2 结果与讨论

2.1 实验结果及建模

利用Design Expert 8.0软件，选择Box-Behnken设计法进行参数设置，按照生成的实验方案进行实验，得到对应的降解液吸光度A450值。实验方案及结果见表3。

根据表3数据，利用软件进行二次多元回归拟合，对所得模型进行显著性检验，得出降解液吸光度响应值Y(A450)对加煤量(A)，接种量(B)，降解时间(C)的二次多项式回归方程见公式(1)和公式(2)，其中公式(1)中的自变量为实际值，公式(2)中的自变量为代码值。

Y(A450)=-14.862 88+69.894 25A+5.127 45B+0.711 85C-3.022 50AB-0.083 333AC+0.050 042BC-117.255 00A2-0.936 80B2-0.028 474C2

(1)

Y(A450)=5.59-0.75A+1.07B+0.62C-0.30AB-0.050AC+0.30BC-1.17A2-0.94B2-0.1.03C2

(2)

表3 Box-Behnken设计实验及结果Table 3 Designed experiments and its results by Box-Behnken method

2.2 模型的可信度分析

对2.1节中拟合所得的恶臭假单胞菌降解光-氧氧化胜利褐煤(GSLH)过程的模型进行显著性检验，回归模型的系数显著性检验见表4(其中，df为自由度；F为统计量检验值；P为显著性检验值；**表示影响非常显著(P<0.01))。

表4 响应曲面模型的二次回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表4还可知，在二次模型中，一次项A，B和C对响应值Y(A450)的影响均非常显著(P<0.01)；二次项A2，B2和C2对指标Y(A450)的影响都非常显著(P<0.01)；交互项中，AB对响应值Y(A450)的影响较显著(P<0.01)，AC对指标Y(A450)的影响不显著(P>0.05)，BC对指标Y(A450)的影响非常显著(P<0.01)。

图1所示为标准曲线残差概率与学生化残差概率的拟合曲线。由图1可以看出，实验点分布均匀，标准曲线具有较好的拟合性，残差基本满足正态分布，可用该回归方程对恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的降解效果进行预测分析。

图1 残差的正态概率分布拟合曲线Fig.1 Fitting curve of normal probability distribution of residuals

2.3 工艺条件的响应面分析及优化

恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤工艺条件的响应面函数模型和等高线见图2～图4。由此可更直观地说明，加煤量、接种量和降解时间对降解液吸光度A450值的影响及因素间交互作用的强弱。其中，等高线形状可以判断降解过程中加煤量、接种量和降解时间两两之间的交互作用强弱，且在同一条等高线上所有降解方案都得到相同的降解液吸光度A450值。其坡度趋势越陡则代表变化的趋势越明显，对实验指标影响则越大，而且通过得到的响应曲面可以很直观地看出指标受各条件因素影响的程度大小[23-25]。

图2所示为降解时间为12 d时，加煤量与接种量对恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤降解液吸光度的等高线和响应曲面。由图2可知，当接种量接近1.0 mL/20 mL时，随着加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐渐增大后逐渐减小。当接种量接近3.0 mL/20 mL时，随着加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐增大后快速减小；当加煤量接近0.20 g/20 mL，随着接种量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度缓慢增大，最后趋于平缓。由此可知，加煤量和菌株接种量之间存在一定的相互影响，当加煤量较小时，接种量增大到一定值后再持续增大，菌株对于煤的降解作用并不会增大。这是由于，当加煤量较小时，当细菌分泌的降解煤活性物质(碱、酶、螯合剂和表面活性剂等)与煤结构中对应的活性点反应以后还有过剩；当加煤量过大时，煤浆浓度过大会对细菌产生抑制作用，导致细菌生长繁衍受阻，导致分泌的降解煤活性物质量减少，从而降解效果变差，所以加煤量和菌株接种量要有一个合理配比，才能达到最佳降解效果。再根据F=79.11，P<0.000 1，可知加煤量与接种量的交互作用对降解液吸光度的影响显著[21]。

图2 加煤量和接种量对降解液吸光度的等高线和响应曲面Fig.2 Effect of coal amount and inoculum size on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

图3所示为接种量为2.0 mL/20 mL时，加煤量与降解时间对恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤降解液吸光度的等高线和响应曲面。由图3可知，当降解时间接近6 d时，随着加煤量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先缓慢增大后徐徐减小，趋势平缓；当加煤量接近0.20 g/20 mL时，随着降解时间延长，菌株降解煤所得降解液的吸光度缓慢增大，最后趋于平缓。由此可知，加煤量和降解时间之间存在一定的相互影响，但曲面变化趋势较平缓，且当降解时间延长至一定值后再持续增大，菌株对于煤的降解效果并无明显变化。再根据F=2.16，P=0.184 7>0.05可知，加煤量与降解时间二因素间的交互作用对降解液吸光度的影响不显著。

图3 加煤量和降解时间对降解液吸光度的等高线和响应曲面Fig.3 Effect of coal amount and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

图4所示为加煤量为0.3 g/20 mL时，降解时间与接种量对恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤降解液吸光度的等高线和响应曲面。由图4可知，当接种量接近1.0 mL/20mL时，随着降解时间延长，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐渐增大后逐渐减小；当降解时间接近6 d时，随着接种量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先缓慢增大，最后稍有降低。结合等高线可知，当降解时间在12 d到15 d之间，菌株接种量在2.5 mL/20 mL至3.0 mL/20 mL之间时，菌株降解煤所得的降解液吸光度可以达到较佳值。根据F=78.07，P<0.000 1可知，降解时间与接种量的交互作用对降解液吸光度的影响显著。

图4 接种量和降解时间对降解液吸光度的等高线和响应曲面Fig.4 Effect of inoculum size and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

按照实际因素多元二次方程回归拟合所得的模型方程，根据快速上升法，软件给出恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的最佳工艺条件为：加煤量0.26 g/20 mL、 接种量2.71 mL/20 mL、降解时间14.50 d，对应降解液的吸光度A450值为6.256 87。

按照最佳工艺条件，进行三组平行验证实验，实际测得降解液的吸光度A450的平均值为5.936，与模型预测值偏差5.12%，偏差较小。因此，可认为利用响应曲面分析法得到的恶臭假单胞菌降解光-氧氧化胜利褐煤的模型可信度高，得到的降解工艺条件具有一定的实际应用价值。

按照此最佳工艺条件进行恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的实验，降解率为40.98%，降解液体产物的正己烷萃取物中含有34种化合物，主要为酯、杂环化合物、酰胺、烷烃和烯烃，可进一步研究从降解液中分离提取烃类燃料油和其他化学品。

3 结 论

1) 利用Design-Expert 8.0软件，通过Box-Behnken设计建立响应曲面模型，经分析发现二次模型的失拟项不显著，复相关系系数为0.999 0，模型拟合度好、可靠性高。在二次模型三个因素中，一次项和平方项均对响应值影响显著；交互作用中，加煤量和接种量、接种量和降解时间之间的交互作用显著，而加煤量和降解时间之间的交互作用不显著。

2) 响应曲面优化得出的恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的最佳条件为：加煤量为0.26 g/20 mL、接种量为2.71 mL/20 mL、降解时间为14.50 d，对应降解液的吸光度A450值为6.256 87。验证实验实际测得降解液的吸光度A450值为5.936，模型预测值偏差5.12%，与理论值较为一致，可见该模型较好模拟了各变量因素和响应值之间的关系。

3) 按照此最佳工艺条件进行恶臭假单胞菌降解光-氧氧化内蒙胜利褐煤的实验，降解率为40.98%，降解液体产物的正己烷萃取物中含有34种化合物，主要为酯、杂环化合物、酰胺、烷烃和烯烃，可进一步研究从降解液中分离提取烃类燃料油和其他化学品。