HPLC法测定兴安柴胡中柴胡皂苷d的含量

郭司群 迟晓雪 白雅静 王怀刚

1.呼伦贝尔市食品药品检验所，内蒙古 呼伦贝尔 021008；2.呼伦贝尔市草原工作站，内蒙古 呼伦贝尔 021008

柴胡原名花胡，始载于《神农本草经》列为上品。药用柴胡资源将近30种，主要分布于我国西南、西北和东北地区[1]。《中国药典》1963年版收载了柴胡B.chinenseDC.和狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.；1977年版根据各地习用柴胡物种的实际情况，除收载上述两种外，收载了“及其同属数种植物”；《内蒙古中药材标准》1988年版收载兴安柴胡药材为伞形科植物兴安柴胡BupleurumSibircumVest的干燥根。具有疏散退热、舒肝、升阳的功效。但标准中未对兴安柴胡的含量进行规定[2]。

研究证明柴胡属植物含有柴胡皂苷、挥发油、甾醇类、萜类、生物碱、黄酮、木脂素、香豆素、有机酸、多糖、氨基酸、多肽、香豆精等成分。从柴胡属多种植物中已分离出多种皂苷类成分。主要分布在根部。皂苷类成分中含量较高的有柴胡皂苷a、d[3]，本实验通过建立高效液相色谱法，对兴安柴胡中皂苷d的含量测定进行研究。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 KQ2200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Sartorius BSA224S型、BP211D型电子天平(德国赛多利斯科技有限公司)； 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(SCL-10ATvp型控制器，SPD-10Avp型二极管阵列检测器，LCsolution色谱工作站)。

1.2 试药与试剂 柴胡：样品经性状与显微鉴别确定为兴安柴胡；对照品：柴胡皂苷d 来源于中国食品药品检定研究院，批号为110778-201711，纯度95.8%；乙腈(色谱纯Fisher Chemical)；甲醇(色谱纯Fisher Chemical)；氨水(分析纯)；自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters SunFireTMC18(5 μm,4.6 mm×250 mm)； 流动相：乙腈-水(按下表进行梯度洗脱)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μL。

时间/min流动相A/%流动相B/%0～5525→9075→1055～609010

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.5 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液50 mL，密塞，30 ℃水温超声处理(功率200 w，频率40 kHz)30 min，滤过，用甲醇40 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，70 ℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液20 μL与供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。如图1和图2所示。

图1 柴胡皂苷d对照品溶液HPLC色谱图

图2 兴安柴胡供试品溶液HPLC色谱图

2.3 测定方法的选择 由于柴胡皂苷类化合物的结构中所含双键很少，因此使用紫外检测器时只能用末端吸收(203～210 nm)进行检测，虽然蒸发光散射检测器(ELSD)检测不依赖样品光学性质，可以消除流动相配比变化对基线产生的影响，但受漂移管温度、气流速度等条件影响，测定过程相对复杂。所以本试验采用紫外检测方式。虽然样品容易受到流动相等各种试剂的干扰使基线不稳，影响定量，但可通过仔细地选择色谱条件获得较好的结果。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系试验 精密称定柴胡皂苷d对照品0.01265 g，置25 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.5 mg的储备溶液。精密量取上述储备溶液1 mL、2.5 mL、5 mL和7.5 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成柴胡皂苷d的0.05 mg/mL、0.12 mg/mL、0.25 mg/mL和0.38 mg/mL系列浓度溶液。分别精密量取上述储备溶液和系列浓度溶液各20 μL分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以浓度X(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。见表1。

表1 线性回归方程

2.4.2 精密度试验 精密称定柴胡皂苷d对照品0.01322 g，置25 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取溶液20 μL，连续进样5次，柴胡皂苷d峰面积的RSD为1.0% ，表明精密度良好。见表2。

表2 精密度试验结果

表3 稳定性试验结果

2.4.3 稳定性试验 精密称定柴胡皂苷d对照品0.01239 g，置25 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，按含量测定项下色谱条件操作，测得柴胡皂苷d的峰面积，并将滤液分别放置2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按含量测定项下色谱条件分别注入液相色谱仪，记录柴胡皂苷d的峰面积，RSD为0.2%，表明柴胡皂苷d溶液在24 h内稳定性良好。见表3。

2.4.4 重复性试验 取兴安柴胡1号样品5份，各约1.0 g，精密称定，分别按含量测定项下方法操作，测得每份样品中柴胡皂苷d的含量，结果见表4，表明重现性良好。

表4 重复性试验结果

2.4.5 回收率试验 取兴安柴胡1号样品(柴胡皂苷d含量为0.151%)9份，精密称定，依次精密加入5.2项下柴胡皂苷d储备溶液1.4 mL、1.4 mL、1.4 mL、1.8 mL、1.8 mL、1.8 mL、2.2 mL、2.2 mL、2.2 mL，分别按含量测定项下方法操作，测定每份中柴胡皂苷d的含量，计算回收率，结果见表5。

2.5 样品含量测定 取7批兴安柴胡样品按含量测定项下方法处理并测定，7批样品的测定结果见表6。

表5 柴胡皂苷d加样回收试验结果

表6 7批样品中柴胡皂苷d含量测定结果

3 讨论

柴胡皂苷为齐墩果烷型三萜皂苷，极性较大，易溶于甲醇、乙醇，常用溶剂法进行提取。柴胡皂苷d因具有环氧醚键结构而不稳定，在酸性或高温条件的影响下，其环氧醚键易开环，因为本次实验选择超声提取的方式。

参考2015年版《中国药典》一部中柴胡含量测定项下的提取溶剂，故本次实验考察了水、甲醇和5%浓氨试液的甲醇溶液3种提取溶剂，结果表明5%浓氨试液的甲醇溶液提取柴胡皂苷d含量最高，水的提取柴胡皂苷d含量最低，故提取溶剂选择5%浓氨试液的甲醇溶液。实验共考察了20 ℃、30 ℃和40 ℃3个超声水温，结果表明40 ℃水温超声对柴胡皂苷d有一定的影响，使其柴胡皂苷d的含量降低。20 ℃和30 ℃柴胡皂苷d的含量差别不大，但考虑到20 ℃水温超声温度不宜控制恒定，故选择30 ℃水温超声提取。

实验结果表明建立的高效液相色谱法简便可行、结果准确，可用于兴安柴胡的质量控制。