苗医“石弱骨虚”大鼠模型复制及几种淫羊藿的干预作用

徐 婷 袁青青 陈 娟 龚 毅 刘晓龙 钱海兵

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

苗医“五基成物学说”中认为，光、气、水、土、石是构成世界的基本元素，其中石是构成人体的基本元素之一。石的质地坚硬，用以构造人体的骨骼以支撑起人体的肢体、构成牙齿以咀嚼各种食物，是人体支架的基本物质[1]。根据苗医描述，可以认为这里的石类元素事实上是为矿物质的代表，如钙、磷、锌等。故当机体吸收石类元素的能力较弱或是所吸收不足时，必然导致骨虚，即“石弱骨虚”。针对这一病理状态，常以补火药进行治疗以达到补石健骨、补精水、填骨髓的治疗目的[2]。

淫羊藿性温，味甘、辛，主要具有补肾阳、强筋骨、祛风湿、助阳益精的功效，临床常用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛等症。药理学研究表明，淫羊藿能够提高免疫力、增强性功能、抗肿瘤、降血糖、抗炎、治疗骨质疏松等[3]。

近年来，苗医药的研究日渐增多，苗药产业成为产值最大的民族医药产业之一，但对于苗医药的基础研究相对较少，特别是适合苗药研究的实验动物模型更是少有研究，这也成为苗医要理论系统研究和产业化的深度发展的瓶颈之一。本研究将在重大基础课题的支持下，依据苗医药的记载，“石弱骨虚”是因为骨髓不足，骨失濡养和机体吸收石类元素不足所致[1]，故本研究将以“石弱骨虚”理论为指导，以促进动物机体石类元素的流失和减少动物机体对石类元素的吸收为建模依据，采用去除大鼠双侧卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸钠+给予2.5%氯化锶水溶液的方法复制“石弱骨虚”模型，再在以方测证的研究方法下，采用贵州地区常用的改善“石弱骨虚”证候的几种淫羊藿：粗毛淫羊藿(E.acuminatum)、黔岭淫羊藿(E.leptorrhizum)和巫山淫羊藿(E.wushanense)进行干预，探索复制“石弱骨虚”模型，并揭示苗药淫羊藿治疗“石弱骨虚”的现代科学内涵，以期为苗医药基础研究提供符合苗医药基本学说的实验动物模型。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠40只，体重(200±20)g，动物饲料均由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 药品和试剂 雌二醇(E2，批号：C0139050102)、钙离子(Ca2+，批号：Cat#：DALP-048)、25羟基维生素D3(25(OH)D3，批号：C0139030100)、1,25二羟基维生素D3(1，25(OH)2D3，批号：C0139040101)、骨钙素(BGP，批号：V15013956)、碱性磷酸酶(ALP，批号：Cat#：DICA-048)均购于武汉华美生物科技有限公司；磷(P)测试盒(磷钼酸法)(批号：20180706，南京建成生物工程研究所)；水合氯醛(批号：20180627，天津科密欧化学试剂有限公司)；氯化锶(批号：20180110，成都科隆化学品有限公司)；地塞米松磷酸钠注射液(批号：180209283，郑州卓峰制药有限公司)。

粗毛淫羊藿、黔岭淫羊藿、巫山淫羊藿均购于贵阳市南明区万东桥药材市场，经贵州中医药大学生药教研室刘晓龙博士鉴定为对应药物。淫羊藿水煎液供试品的制备：各淫羊藿水冲洗弃其杂物，取定量淫羊藿，加20倍量水浸泡30 min，煎煮2 h，第二次加入10倍量水，同样煎煮2 h，合并两次煎煮液，过滤，最后浓缩至相当于生药材1 g/ mL淫羊藿水提液，4 ℃保存备用。

1.3 仪器 离心机，Thermost16R,赛默飞世尔公司；DRHH-S6数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)；infiniteM200酶标仪(北京新风机电技术公司)。

2 方法

2.1 “石弱骨虚”大鼠模型的制备 采用复合模型(去除大鼠双侧卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸钠+给予2.5%氯化锶水溶液)进行模拟造模。40只大鼠随机分为空白组8只和实验组32只，适应性饲养一周。除空白组外，其余大鼠均进行造模，复合模型(去除大鼠双侧卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸钠+给予2.5%氯化锶水溶液)，去除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症模型，并肌肉注射20万U/kg青霉素，连续3 d。去卵巢后第四天开始，除空白组外，其余大鼠均肌肉注射地塞米松磷酸钠注射液(1 mg/kg，一周两次)，同时每天给予2.5%氯化锶自来水溶液自由饮水，避光饲养，模型制备共计2个月。

2.2 分组及干预 实验组均进行造模处理，将造模成功后的32只大鼠随机分为以下4组：模型组、粗毛淫羊藿组、黔岭淫羊藿组、巫山淫羊藿组，每组8只，灌胃给药，1次/d，三组淫羊藿组灌胃剂量均为4g/kg(按照人临床剂量折算，相当于人临床剂量的8倍)；空白组、模型组灌胃等体积的饮用水；连续给药2个月。

2.3 标本制备 实验时间到4个月时，所有大鼠取材前一晚禁食不禁水12 h，并进行称重，4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，静置2 h，3000 rpm离心10 min，分离血清，并将血清分装在小EP管中，-80 ℃冰箱保存，备用。取大鼠左侧股骨与胫骨，并分别称重，记录。

2.4 指标的检测

2.4.1 大鼠胫骨和股骨的重量 取大鼠左侧股骨与胫骨，并分别称重，记录。

2.4.2 ELISA试剂盒检测 取大鼠血清测定E2、Ca2、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、BGP、ALP，严格按ELISA试剂盒说明书操作。

3 结果

3.1 胫骨和股骨重量结果 与空白组比较，模型组大鼠胫骨和股骨重量均显著降低(P<0.01)，提示模型组大鼠骨重量降低，骨健康程度严重下降，与苗医“石弱骨虚”表述相对应，显示造模成功；与模型组比较，黔岭淫羊藿组和巫山淫羊藿组胫骨和股骨重量有所升高(P<0.05)，粗毛淫羊藿组大鼠胫骨重量所增加(P<0.05)，提示三种淫羊藿作为常用苗药可在一定程度上使“石弱骨虚”模型大鼠骨重量增加，改善大鼠的骨健康程度。结果见表1。

表1 药物干预对各实验组大鼠胫骨和股骨重量的影响

3.2 血清生化指标检测

3.2.1 对大鼠血清中E2、Ca2+、P含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中E2、Ca2+、P含量显著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型组大鼠骨形成与骨吸收动态平衡被破坏，进一步导致大鼠骨矿化速率受到严重抑制，与“石弱骨虚”临床表现相对应，显示造模成功；与模型组比较，黔岭淫羊藿组大鼠血清中E2、Ca2+、P含量均明显升高(P<0.05)，粗毛淫羊藿组大鼠血清中Ca2+和P含量均明显升高(P<0.05)，巫山淫羊藿组大鼠血清中E2含量明显升高(P<0.05)，提示三种淫羊藿作为常用苗药可在一定程度上促进大鼠骨形成，抑制大鼠骨吸收，进一步使骨吸收与骨形成保持动态平衡，改善“石弱骨虚”骨代谢。结果见表2。

表2 药物干预对各实验组大鼠血清中E2、Ca2+、P含量的影响

3.2.2 对大鼠血清中25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量显著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型组大鼠肠道对钙磷元素的吸收减少，与苗医“石弱骨虚”理论描述接近，显示造模成功；与模型组比较，粗毛淫羊藿组和巫山淫羊藿组大鼠血清中的25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量明显升高(P<0.05)，提示三种淫羊藿作为常用苗药可在一定程度上增加肠道对钙磷元素的吸收，从而提高骨健康程度。结果见表3。

表3 药物干预对各实验组大鼠血清中25(OH)D3和1，25(OH)2D3含量的影响

3.2.3 对大鼠血清中BGP和ALP含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中BGP和ALP含量显著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型组大鼠成骨细胞活性严重下降，从而导致骨形成受到严重的抑制，与“石弱骨虚”模型相对应，显示造模成功；与模型组比较，巫山淫羊藿组和粗毛淫羊藿组大鼠血清中BGP和ALP含量明显升高(P<0.05)，黔岭淫羊藿组大鼠血清中BGP含量明显升高(P<0.05)，提示三种淫羊藿作为常用苗药可在一定程度上增加成骨细胞的活性，从而促进骨形成。结果见表4。

表4 药物干预对各实验组大鼠血清中BGP和ALP含量的影响

4 讨论

苗医理论中认为“石弱骨虚”这一病症多由气血亏损，或营养不足，耗量过大以致血亏气短，久则累积骨质而成疾，或先天禀赋不足，壮年房事过多，耗气耗血，伤肾成疾。可表现为：腰背疼痛、四肢无力、双腿酸软和足跟骨痛等症状[2]，与临床所见骨质疏松症状有一定的相似性。因此，本实验通过去除大鼠双侧卵巢和对大鼠进行肌肉注射糖皮质激素导致大鼠体内钙元素的大量流失，诱发骨质疏松；并且以高浓度(2.5%)氯化锶抑制钙吸收作为切入点，以模拟苗医学“石弱骨虚”证病因中因气血亏虚，营养不足，石类元素摄入不足的发病机制，进行“石弱骨虚”模型的制备。因而本实验通过去除大鼠双侧卵巢模拟绝经后机体雌激素降低和钙大量流失的“石弱骨虚”状态[4-6]，并以超生理剂量的糖皮质激素造成石类元素的流失，进一步导致骨虚。氯化锶是一种水溶性物质，低浓度的氯化锶促进钙吸收，高浓度氯化锶(2.5%～4%)抑制25(OH)D3合成，减弱肠道对钙的吸收，损害骨矿化，导致骨骼发育障碍[4-6]。

骨是雌二醇(E2)发挥作用的重要靶器官之一，在多种骨细胞中(如成骨细胞和破骨细胞等)，均有雌激素受体α和β的存在。E2是卵巢分泌的一类类固醇激素，是雌激素的主要组成部分。研究表明，E2在维护皮质骨的形成、支持成骨细胞、防止骨吸收、抑制破骨细胞形成和刺激破骨细胞凋亡中发挥了主导作用[8]。E2含量降低可导致大鼠骨形成与骨吸收动态平衡被破坏，进而抑制大鼠骨矿化速率。“石弱骨虚”模型复制后，与空白组比较，模型组大鼠骨健康程度降低，骨重量减轻，骨质流失，E2含量降低；淫羊藿治疗后，对比模型组，E2含量恢复接近于正常水平。说明淫羊藿可促进大鼠骨形成，抑制大鼠骨吸收，进而使骨吸收与骨形成保持动态平衡。

人体99%的钙与磷酸和羟基结合形成羟基磷灰石晶体，贮存于骨骼和牙齿，是骨形成和骨重建阶段所必需的物质。 骨钙代谢包括骨形成和骨吸收两个过程，在生化过程中通过离子交换，使钙的吸收和释放相等，保持骨钙的动态平衡。磷是组成骨骼中无机盐的重要组分，亦是参与骨代谢的重要无机营养素，与钙以 1∶2左右比例结合形成骨矿物质[9]。“石弱骨虚”模型复制后，与空白组比较，模型组大鼠Ca2+、P含量降低；淫羊藿治疗后，对比模型组，Ca2+、P含量恢复接近正常水平。说明淫羊藿可抑制骨吸收，促进骨矿化，进而稳定血钙、磷的含量。

维生素D是一种脂溶性维生素，包括维生素D3(VD)3和维生素D3(VD)2两种形式，是通过调节肠道钙吸收途径中的多种蛋白的结构或表达水平影响钙的吸收，维生素D经过肝脏羟化作用变成为25(OH)D3，它是维生素D的前体，也是维生素D最稳定的代谢产物，经过肾脏再羟化成1,25(OH)2D3，被称为骨化三醇，1,25(OH)2D3可与维生素D受体结合作用于DNA上的一个由200多个基因组成的片段，活化后调控基因表达，调节肠道对钙、磷的吸收，维持血钙、磷水平，保证骨骼和牙齿的正常生长发育[10]。“石弱骨虚”模型复制后，与空白组比较，模型组大鼠25(OH)D3、1,25(OH)2D3含量减少；淫羊藿治疗后，对比模型组，25(OH)D3、1,25(OH)2D3含量升高。说明淫羊藿可促进肠道对钙、磷的吸收，维持血钙、磷的平衡，恢复骨健康程度。

BGP是由成熟的骨细胞和成骨细胞合成与分泌，是成骨细胞的标志，在骨组织矿化和成骨细胞分化增加时，骨钙素也随之特异增加，所以其含量的多少可间接反应成骨细胞的活性[11]。主要生理功能是维持骨的正常矿化速度，可直接反映骨形成的状况[12]。ALP存在各种组织中，如肝、肾、骨、小肠等，其中有50%的ALP来源于骨组织。骨组织中的ALP由成骨细胞合成，它能在碱性条件下，水解骨钙化区域中的磷脂，释放磷酸根，释放的磷酸基团可与钙发生结合，以沉淀的形式沉积在胶原骨架上，在骨矿化中起到重要作用[13]。ALP可以破坏钙化抑制剂，使得钙和磷可结合到胶原分子的胶原氨基酸残基上，进而使成骨细胞钙化加强[14]。“石弱骨虚”模型复制后，与空白组比较，模型组大鼠BGP、ALP含量降低；淫羊藿治疗后，BGP、ALP含量恢复接近于正常水平。说明苗医常用的三种淫羊藿可提高成骨细胞活性促进骨形成，稳定骨矿化速率。

本实验复制“石弱骨虚”模型后结果显示，大鼠胫骨、股骨重量、E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、 BGP、ALP含量均降低，说明该模型可以导致大鼠骨形成减少，骨吸收增加，骨矿化速率被抑制，这些病理过程的变化与临床“石弱骨虚”病人的病理过程基本相似，其症状表现与四肢无力、双腿酸软和足跟骨痛也有相似之处。说明本实验所复制的复合模型(去除大鼠双侧卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸钠+给予2.5%氯化锶水溶液)可在一定程度上与苗医理论中“石弱骨虚”的含义相对应，表明模型大鼠复制成功，为苗医“石弱骨虚”证的研究复制了可以借鉴的实验动物模型。

实验给予药物干预后结果显示，血清中E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1，25(OH)2D3、BGP和ALP的含量升高，说明淫羊藿可通过改变与骨形成、骨吸收、骨矿化密切相关重要生化指标，进而通过提高成骨细胞的活性、促进骨形成、增加骨矿化、增加骨量、稳定骨矿化速率、促进血钙、磷平衡、改善骨组织健康状态等方式增加大鼠胫骨和股骨的重量，以此来改善大鼠“石弱骨虚”的状态。因此，淫羊藿作为苗医临床常用于治疗“石弱骨虚”的药物，具有药理学基础，与其提高大鼠胫骨和股骨的重量、升高大鼠血清中E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、BGP和ALP的含量有关，同时从“以药测证”的角度来看，进一步证明本研究所复制的实验动物模型具有一定的临床依据。

本研究基本上复制了符合苗医“石弱骨虚”的疾病动物模型，并采用苗医常用的“补火药”淫羊藿进行了模型的初步验证，为复制适合苗医药研究的疾病动物模型进行了有益的探索，但更深入的研究和更多的验证仍需继续研究。