枳实药材的色谱-质谱联用指纹图谱

陈 鑫，陈玉宇

(泰州医药高新技术产业园区管理委员会，江苏 泰州 225300)

枳实为芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的干燥幼果[1]，植物形态为常绿小乔木，有长刺。单叶互生，革质，叶柄有狭长形或倒心脏形的翼；叶片长椭圆形，有半透明油点；花排列成总状花序；花萼杯状，5裂；花瓣5，白色，长椭圆形；柑果圆形而稍扁，成熟时橙黄色。花期4～5月，果期6～11月。枳实呈半球形，少数为球形，直径0.5～2.5 cm。外果皮黑绿色或暗棕绿色，具颗粒状突起和皱纹，有明显的花柱残迹或果梗痕，切面中果皮略隆起，厚0.3～1.2 cm，黄白色或黄褐色，边缘有1～2列油室，瓤囊棕褐色，质地坚硬。气清香，味苦、微酸。主产于四川、江西、福建、江苏等地，具有破气消积、化痰散痞等功效。主要用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂等。目前，对于枳实药材的研究，虽然除了对于主要化学成分的含量测定以外，也包含大量的HPLC图谱研究和其他指纹图谱，但也存在一些不足。目前已有文献[2-17]对枳实的指纹图谱进行研究，标定了其中一些有效成分，本文在此基础上采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS联用色谱技术建立了枳实高效液相色谱指纹图谱，经黄酮类标准图谱对照和HPLC-ESI/DAD-TOF-MS总离子流信息鉴定10个共有峰，进而建立了14批枳实特征色谱指纹图谱，此方法将色谱质谱联用技术应用在枳实的指纹图谱分析中，方法新颖、特征峰多、信息量大的良好特点，这种相结合的分析方法是科学的、系统的、全面的，从而有利于中药科学的质量控制，为枳实的全面研究提供参考；为该药的进一步开发和利用提供重要参考依据和有力手段；也为全面探究枳实活性成分提供了切实的依据。本文建立的枳实药材综合指纹图谱，采用相似度评价系统对不同产地不同生产厂家的枳实药材进行了差异甄别，为鉴定枳实药材成分差异、控制药材质量奠定了夯实的基础，使其生产达到规范化、稳定化、现代化，为其它天然药物的研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Shimadazum LC-10Advp高效液相系统；配套真空脱气机、自动进样器及柱温箱；UV检测器；LC-Solution工作站；

Agilent 1260高效液相色谱仪配二极管阵列检测器，美国Agilent；Agilent 6224 TOF-LC-MS系统，配备电喷雾离子源(ESI 源)以及Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件，美国Agilent；AB135-S分析天平，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；LIBROR AEU-210 1/1 万电子天平，Japan Shimadzu；KQ-500VDB型超声波清洗器，昆山超声仪器厂；Beckman Avanit J-E高速离心机，美国Beckman coulter；CW130粉碎机，上海天祥健台制药机械有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海索谱仪器有限公司。

1.2 材 料

枳实品种如表1所示，经鉴定为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种或甜橙(CitrussinensisOsbeck.)的干燥幼果，样本现保存于江苏省南京市中国药科大学。

对照品：柚皮苷(分子式C27H32O14，CAS号10236-47-2，批号：12030612)，橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS号250-26-3，批号：12020304)，新橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS号13241-33-3，批号：12030701)对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，规格均为20 mg/支，纯度≥98%。

试剂：甲醇(特级纯)，南京晚晴化玻仪器有限公司；乙酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；水为纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

表1 不同产地及不同炮制品的枳实

2 方法与结果

2.1 色谱条件

带有预柱的汉邦Phecda C18色谱柱(150×4.6 mm，5 μm)，流动相为2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min (5%～15% B, 95%～85% A)，10～15 min (15%～20% B, 85%～80% A)，15～20 min (20%～30% B, 80%～70% A)，20～25 min (30%～36% B, 70%～64% A)，25～40 min (36% B, 64% A)，40～45 min (36%～65% B, 64%～35% A)，45～50 min (65%～80% B, 35%～20% A)，50～55 min (80%～95% B, 20%～5% A)，55～60 min (95% B, 5% A)，60～65 min(95%～5%B, 5%～95% A)，65～75 min (5% B, 95% A)；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长283 nm；进样量10 μL；分析时间为75 min。

2.2 质谱条件

电喷雾(ESI)离子源；采用正离子和负离子模式检测；脱气溶剂气流量8 L·min-1；脱气溶剂温度350 ℃；雾化室压力：30 Psig；毛细管电压3.5 kV；TOF检测电压120 V；捕捉电压65 V；每1 s采集一次图谱；全扫描(MS scan)，质量扫描范围：m/z 100～1000；实验数据采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件处理。

2.3 供试品溶液的制备

取14份不同的枳实药材适量，采用CW130粉碎机粉碎，在温度为60 ℃下烘干。分别称取枳实药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，用KQ-500VDB型超声波清洗器设置超声提取时间为30 min，放冷，过滤，滤液置50 mL容量瓶中，滤渣重复提取1次，合并滤液，定容。提取液于高速离心机下16000 r·min-1离心10 min，取上清，进样。

2.4 对照品溶液的制备

分别精密称量新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷对照品适量，用适量甲醇溶解配成浓度约1 mg·mL-1的储备液，分别稀释至所需的混合对照品储备液。-20 ℃保存，备用。待进液相和质谱。

2.5 测定方法

精密量取上述混合供试品溶液和对照品溶液，进样量10 μL，分析时间为75 min，注入高效液相色谱仪和Agilent 1260高效液相色谱仪配二极管阵列检测器及Agilent 6224 TOF-LC-MS系统，记录时间为75 min色谱图，色谱图见图1和图2，质谱图见图5和图6。

图1 枳实药材供试品的高效液相色谱图

图2 对照品指纹图谱

2.6 方法学考察[2]

2.6.1 精密度实验

分别吸取同一(本实验选择的编号为S1枳实样品)供试品溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，记录高效液相色谱图。计算相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明：所有共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.32%，相对峰面积的RSD值小于1.25%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性实验

取同一(本实验选择的编号为S1枳实样品)供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次。计算相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明：所有共有峰的相对保留时间RSD值小于0.12%，相对峰面积的RSD值小于1.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.3 重现性实验

取同一批枳实(本实验选择的编号为S1枳实样品)6份，按照枳实供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液，记录高效液相色谱图。计算相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明：所有共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.25%，相对峰面积的RSD值小于2.18%，表明方法重现性良好。

2.7 枳实药材指纹图谱的建立、测定及分析[19]

2.7.1 指纹图谱分析软件的应用

按照上述确定的色谱-质谱条件和供试品溶液的制备方法，测定了14批不同产地和不同炮制方法的枳实的色谱质谱联用技术的指纹图谱。因图谱中各个物质分离度良好，含量较高，所以选其作为枳实药材质量和活性的指标。采用国家药典委编的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版》。参数设置如下：采用序号S1枳实样品作为相似度计算时校正的参照图谱；选取0.10 min为“时间窗宽度”；选用多点校正的“校正方式”。

图3 14批枳实药材的高效液相指纹重叠图谱(S1～S14代表样品组别从1到14)

高效液相色谱指纹图谱的生成：选择编号从S1到S14的共14批枳实药材色谱图生成高效液相色谱重叠图谱见图3，软件生成的对照高效液相色谱-质谱指纹图谱见图4，通过软件就算的相似度计算结果见表3。

图4 软件生成的枳实药材对照指纹图谱

图5 放大的枳实药材总离子流图谱

图6 枳实(样品1)总提取物的正离子模式(a)和负离子模式总离子流图(b)

2.7.2 共有峰的确定

精密量取14批枳实供试品溶液，记录枳实药材总离子流色谱图，通过比对相同保留时间的紫外光谱图，最终选择了10个特征峰作为指纹图谱的共有峰，见图5。经HPLC-ESI/DAD-TOF-MS检测得到枳实中各化学成分的保留时间和质谱信息，并结合提取离子流图(“ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI(-)/DAD-TOF-MS”的质谱总离子流图(TIC)，见图(6)及与对照品、相关文献数据[20-31]对比，从而对枳实进行化学成分确认，样品中分析鉴定的成分见表2。

枳实药材的总离子流色谱图中，保留时间为39.886 min，43.696 min处出现2个色谱峰，它们具有相同的相对分子质量，但具有不同的保留行为，其提取离子色谱图见图6。其中，通过与对照品比对，确定保留时间为39.886 min的色谱峰为新橙皮苷，43.696 min的色谱峰为橙皮苷。

其中tR为34.833 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为581，579的离子峰，其保留时间及质谱行为与柚皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为柚皮苷。tR为39.886 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为611，609的离子峰，其保留时间及质谱行为与新橙皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为新橙皮苷。tR为43.696 min的峰在ESI+，ESI-模式下分别得到m/z为611，609的离子峰，其保留时间及质谱行为与橙皮苷对照品相一致，据此确定该化合物为橙皮苷。

tR为28.886 min，相对分子质量596.1736，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H32O15，可知是圣草次苷或新北美圣草苷。

tR为29.781 min，相对分子质量535.1624，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C22H31O15，可知是苦橙甙(aurantiamar)。

同时根据已报道的文献，将各物质出峰的先后顺序、ESI+，ESI-模式下分别得到m/z等与文献中的信息相比对，以及采用软件处理得到的误差，可以推测tR为26.014 min的色谱峰m/z理论值为178.0266，m/z实测值为178.031，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C9H6O4，可判断为6,7-二羟基香豆素；tR为46.280 min的色谱峰的色谱峰m/z理论值为578.1636，m/z实测值为578.1636，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H30O14，可判断为野漆树苷；tR为48.665 min的色谱峰m/z 理论值为302.079，m/z实测值为302.0776，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C16H14O6，可判断为橙皮素；tR为52.277 min的色谱峰m/z 理论值为342.1103，m/z实测值为342.1099，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C19H18O6，可判断为3',4',7,8-四甲氧基黄酮；tR为54.696 min的色谱峰m/z理论值为388.1158，m/z实测值为388.113，采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C20H20O8，可判断为单羟基五甲氧基黄酮。

最终选择确定这10个峰作为指纹图谱的共有峰，其中峰1为6,7-二羟基香豆素，峰2为圣草次苷或新北美圣草苷(二者为同分异构体)，峰3为苦橙苷， 峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为新橙皮苷，峰7为野漆树苷，峰8为橙皮素，峰9为3',4',7,8-四甲氧基黄酮，峰10为单羟基五甲氧基黄酮。

表2 枳实提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS数据及成分鉴定

2.7.3 特征指纹峰的分析

表3 14批样品相似度评价结果

采用《中药色谱指纹图谱相似度计算软件2004 A版》对14批枳实的指纹图谱进行分析，14批枳实之间的相似度和生成的对照指纹图谱的相似度如表3所示。从表3可以看出，14批枳实的相似度在0.560～0.958之间，14 批枳实药材与生成的对照指纹图谱的相似度在0.572～0.965之间，不同来源、不同批次的枳实药材的特征峰峰高有明显的差异，且相似度也有显著的差异。

3 结 论

本实验首次采用HPLC-DAD/ESI-TOF-MS技术对枳实中的生物碱类和黄酮类成分进行快速分析，根据高分辨质谱获得的母离子信息，结合对照品以及参考文献[20-31]，对枳实中多种化学成分进行了鉴定，为该药材的GAP提供参考。

本实验对枳实药材高效液相指纹图谱的构建进行了探讨，可为枳实药材的品质评价、质量标准的制定提供科学的依据。在其他条件相同的情况下，不同批次枳实药材提取所得的14批枳实药材醇提液的特征峰高及相似度差异较大。因此，采用高效液相指纹图谱技术对枳实的质量控制是极有必要的，可以采用指定厂家，到符合GAP生产管理规范的基地购买道地枳实药材。本方法学建立了枳实药材HPLC-ESI/DAD-TOF-MS联用色谱技术的高效液相色谱指纹图谱，能更好更全面地控制枳实药材的质量。10 峰分别体现了枳实药材的特征，不仅为枳实药材的物质基础研究提供了部分依据，也为其整体上进行质量控制奠定了夯实的基础，充分体现了中医临床用药的特色，为延续挖掘传统中药复方的特色提供了有利手段。