卡那霉素修饰醋酸纤维素膜的制备及应用*

胡梦婷，曾惠琴，黄 露

(闽江学院海洋学院化学工程系，福建 福州 350108)

手性是自然界的本质属性之一。手性药物在吸收、分布、代谢与排泄过程中，通过与体内大分子的不同立体结合，产生不同的药理作用。因此，研究手性问题时应将对映体分开并区别对待。当前，手性拆分方法有很多。其中，膜分离法是一种较新的手性拆分方法，其具有产量高、能耗低、无污染、分离纯度高、易于连续操作等优点，被认为是非常有潜力的大规模手性分离方法，也成为对映体拆分研究的热点之一[1-2]。

通常，用于膜分离的手性选择剂是被整合在膜内的，其能够优先与一个异构体发生相互作用。目前，对映体拆分膜可分为液体膜和固体膜[3]。然而，由于液体膜在工业分离条件下的稳定性较差且寿命较短，因此，用于对映体拆分的主要是固体膜，包括复合材料膜[4]、配体交换膜[5]、氧化石墨烯膜[6]、聚合物膜[7]等。从历史来看，纤维素由于其具有固有的手性性质和现成的可用性，是第一种用作色谱手性选择剂的材料。20世纪60年代，人们首次采用反相技术将醋酸纤维素(CA)制备成膜，并将其广泛用于环境工程、水软化工程等领域中的反渗透、纳滤、超滤、微滤等。尽管，CA膜自身即具有手性，然而其在手性拆分上的表现并不令人满意，亟需采取方法改善CA的手性选择性[8-9]。卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其具有多个手性中心及多个羟基和氨基官能团，是一种非常有潜力的手性选择剂。本文以CA膜为基膜，用高碘酸钠对其进行氧化，然后用卡那霉素(KM)以及氰基硼氢化钠对其进行处理，最后得到手性改性CA膜。由于KM与L-氨基酸、D-氨基酸的结合能力不同，因而对映体具有不同的迁移速率，从而实现对映体拆分。实验考察了酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)对映体在改性后的CA膜中的渗透情况，由此判断所制备的手性改性CA膜是否具有手性选择性。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

UV2550紫外可见分光光度计，岛津仪器苏州有限公司；Spectrum2000傅里叶红外光谱仪，美国PerkinMer公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；THZ-82水浴恒温振荡器，金坛市易晨仪器制造有限公司；PHS-3C台式pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；PFC磁力搅拌器，上海山岳科学仪器有限公司；GZY-P20-W超纯水机，湖南科尔顿水务有限公司。

AC膜(孔径0.45 μm，直径47 mm)，德国Ahlstrom公司；L-Trp、D-Trp、L-Tyr、D-Tyr、L-Phe和D-Phe(纯度98%或99%)，上海源叶生物科技有限公司；氰基硼氢化钠、偏高碘酸钠，Alfa Aesar中国化学有限公司；其他试剂均为分析纯，用水为超纯水。

1.2 KM改性CA膜的制备

将CA膜置于水中浸泡1 h，然后置于50 mL 0.75 M的偏高碘酸钠中进行氧化，在30 ℃恒温条件下磁力搅拌2 h。膜取出后，先用去离子水漂洗三遍，再用磷酸盐缓冲溶液(PBS，5 mM，pH 5.7)漂洗三遍。用上述PBS配制50 mL 2 mM KM溶液，将膜浸泡于该溶液当中，磁力搅拌2 h，KM上的氨基会与CA羟基氧化后的羰基发生反应生成亚胺离子中间体。最后，用上述PBS配制50 mL 10 mM的氰基硼氢化钠溶液，将膜浸泡其中磁力搅拌2 h，使亚胺离子中间体加氢生成仲胺。

1.3 氨基酸对映体的渗析实验

实验采用自制的H型电解池作为渗析实验装置。用50 mL 50 mM的PBS配制1 mM的氨基酸溶液，加到进样池中，并在透过池中直接加入50 mL 50 mM的PBS，PBS的pH依据氨基酸的等电点进行设置。渗析实验在室温下进行，每隔1 h对进样池中样品溶液的吸光度进行检测。将对映体的浓度随渗析时间的变化定义为对映体分离度α：

α=KD/KL

(1)

其中KD和KL分别为D型和L型氨基酸的过膜速率。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 偏高碘酸钠浓度的优化

使用浓度分别为0.1 M、0.25 M、0.5 M、0.75 M、1 M的偏高碘酸钠进行氧化实验。实验发现，偏高碘酸钠浓度越大，醛基含量就愈高。因为氧化剂浓度越大，与CA接触的几率就越大，对氧化反应和醛基形成越有利。但是偏高碘酸钠的溶解度有限，浓度超过0.75 M后，其很难溶解，故选择0.75 M作为偏高碘酸钠的浓度。

2.1.2 偏高碘酸钠氧化时间优化

将氧化时间设为1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h进行对比实验。结果发现，起初氧化时间越长，氧化效果越好，但是当氧化时间大于2 h后，氧化效果并没有很大变化。因此，最佳氧化时间应为2 h。

2.1.3 卡那霉素浓度的优化

通过胺甲基化反应，将KM接在氧化后的CA上。采用浓度为1 mM、2 mM、5 mM的KM进行优化实验。实验结果表明，当KM浓度为2 mM时，酪氨酸和色氨酸的分离度最高，因此，最佳的手性选择剂浓度为2 mM。

2.1.4 氰基硼氢化钠浓度的优化

将羰基跟氨基反应生成的亚胺离子中间体用氰基硼氢化钠还原成仲胺。该反应需在弱酸条件下进行，因为弱酸条件一方面可以使羰基质子化从而增强亲电性，另一方面可以避免胺过度质子化造成的亲核性下降。将氰基硼氢化钠的浓度设为5 mM、10 mM、15 mM进行对比实验。结果表明，当氰基硼氢化钠的浓度为10 mM时，氨基酸的分离度最高，所以氰基硼氢化钠的最佳浓度为10 mM。

2.1.5 渗析实验pH值的优化

由于氨基酸分子中含有羧基和氨基，所以在不相同的pH值下，氨基酸所呈现的状态不相同，因而迁移速率也不相同。三种氨基酸的等电点如下：色氨酸5.89，酪氨酸5.66，苯丙氨酸5.48。课题组以前的结果表明[10]，氨基酸的等电点即为渗析实验的最佳pH值。主要原因可能是，等电点下，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，对手性改性CA膜识别对映体产生的影响最小。

2.1.6 渗析实验PBS浓度的优化

PBS作为缓冲溶液，其浓度对手性改性CA膜与氨基酸的结合能力有一定的影响。采用浓度为25 mM、50 mM、75 mM的PBS进行优化实验，实验结果表明，PBS浓度为50 mM时，酪氨酸和色氨酸的分离度最高。所以，最佳的PBS浓度应为50 mM。

2.2 膜的表征

KM改性CA膜与空白CA膜的红外光谱如图1所示。由图1A可知：KM改性CA膜在2600 cm-1处有最大吸收峰，此处应为NH伸缩振动峰，在1800 cm-1处有羟基的伸缩振动峰；由图3B可知：空白CA膜在750 cm-1左右有最大吸收峰，此处应为C-O-C伸缩振动峰，而在1600处有C=O伸缩振动峰，在1900 cm-1处有羟基振动峰。由于CA是纤维素醋酸酯，因此其含有-OH、C=O、C-O-C等基团，而经KM改性的CA膜，NH2反应后变成NH，并且含有羟基。因此，可以判断KM成功地接在了CA膜上。然而，由于我们所测的是成膜后的膜的红外光谱，所以和用粉末测的红外数据之间有偏差，峰的位置整体发生了频率位移。

2.3 氨基酸对映体的渗析实验

按照1.3部分进行渗析实验，各氨基酸对映体在空白CA膜和KM改性CA膜中的渗透情况如图2和图3所示。图中拟合直线的斜率即为氨基酸的过膜速率，按照公式(1)计算对映体分离度。从图2、3可以看出，无论是在空白CA膜还是KM改性CA膜中，Phe对映体的过膜浓度都表现得极为不稳定，这可能是由于所测浓度接近线性范围下限，测量结果不准确造成的。对于Trp对映体，其D型和L型对映体在空白CA膜和KM改性CA膜中的渗透情况基本一致，改性前后分离度都接近1，即KM改性CA膜对其没有手性选择性。而对于Tyr对映体，其在空白CA膜中的分离度接近1，而在KM改性CA膜中的分离度达到了1.65。这表明，KM改性CA膜对Tyr对映体具有手性选择性。

2.4 手性膜的重复利用性

对KM改性CA膜的重复利用性进行考察，将其用于Tyr对映体的渗透实验，连续使用五次的分离度分别为1.58、1.63、1.79、1.48、1.78，五组数据的相对平均偏差为13%。由此可见，该膜的重复性尚可。

2.5 手性选择机理

Tyr分子结构中除了拥有氨基和羧基，其在苯环上还有一个羟基，可以和膜形成三点相互作用，因而其与膜的结合力最强。这一点从Tyr的过膜速率也可以得到验证。无论是空白膜还是KM改性膜，Tyr对映体的过膜速率均低于Trp对映体。另外，由于Tyr的分子结构比Trp的分子结构小，其对映体与膜之间的相互作用差别也相对较大。因此，KM改性CA膜对Tyr对映体具有手性选择性。而对于Phe对映体，由于检测范围的问题，实验上没有得到可靠数据。尽管如此，我们推断Phe对映体的分离度不会高于Tyr，因为Phe比Tyr少了一个羟基，其与膜只能形成两点相互作用。

图1 KM改性CA膜(A)和空白CA膜(B)的红外光谱图

图2 Trp(A)、Tyr(B)、Phe(C)对映体在空白CA膜中的渗透情况

图3 Trp(A)、Tyr(B)、Phe(C)对映体在KA改性CA膜中的渗透情况

3 结 论

本文对KM改性CA膜拆分氨基酸对映体进行了探究。对影响手性拆分效果的实验条件进行了优化，如氧化剂偏高碘酸钠浓度和氧化时间，KM和氰基硼氢化钠的浓度，以及PBS的浓度和pH。在优化条件下，将KM改性CA膜用于Phe、Trp和Tyr对映体的渗析实验。实验结果表明，KM改性CA膜对Tyr对映体的拆分效果最好。