低比例母体细胞污染对α-地中海贫血产前诊断的影响研究

夏勇 熊礼宽 麦光兴

地中海贫血是我国南方多省常见的单基因疾病[1-2]。近年来地中海贫血的产前筛查和诊断工作都已经逐步的常态化、规范化。其中，对于地中海贫血的产前诊断是防止重症患儿出生的有效手段。对于夫妻双方均为东南亚型（--SEA）α-地中海贫血基因携带者，正确、及时地检出--SEA纯合子对于Hb Bart’s胎儿水肿综合征的干预非常关键。为保证产前诊断结果的准确性，对于母体细胞污染（maternal cells contamination，MCC）的鉴定非常关键。但本实验室在日常临床工作中发现，同时亦有文献报道，低比例的MCC容易被目前常用的MCC鉴定方法漏检，如荧光定量PCR（Quantitative Fluorescence PCR，QF-PCR）[3-6]。低比例MCC还可能严重影响α-地中海贫血的结果判断，甚至可能将Hb Bart’s水肿胎与轻型α-地中海贫血混淆。因此，本研究针对低比例母体细胞污染对α-地中海贫血产前诊断的影响进行研究，以便为后续使用先进的微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术进行低比例MCC提供前期基础。为临床进行正确的产前诊断提供更准确的依据，有效地防止重型α-地中海贫血的漏诊、误诊。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1—10月在深圳市宝安区妇幼保健院经跨越断裂点的PCR技术（Gap PCR）确诊为--SEA/--SEA型地中海地贫基因，即Bart’s水肿胎儿的已检测后废弃新鲜羊水（4～8℃冰箱保存1周内）4例。另收集正常对照孕妇的已检测后废弃新鲜外周血（4～8℃冰箱保存1周内）4例（基因型为αα/αα），孕妇年龄21～37岁，平均年龄（27.48±3.64）岁；孕周18～28周，平均孕周（23.25±2.78）周。本研究已经医院伦理委员会批准，该研究已经研究对象知情同意。

1.2 样本收集和DNA提取

DNA的提取采用广州达安基因股份有限公司的SMART 32全自动DNA提取仪及配套的核酸提取或纯化试剂盒。提取到外周血基因组DNA标本后，采用美国Thermo Fisher公司的Nano One微量核酸蛋白浓度测定仪对浓度进行检测并记录，以备浓度梯度稀释。

1.3 建立 MCC 浓度梯度模型

为保证标本的代表性，将4组地中海贫血基因型为--SEA/--SEA的水肿胎儿的DNA 标本各自与地中海贫血基因为αα/αα的正常对照孕妇的外周血DNA标本，按50 ng的DNA总量，以比例为50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.562 5%进行混合，建立MCC浓度梯度模型。

1.4 MCC鉴定方法

采用广州中山大学达安基因股份有限公司的多倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）以短串联重复序列（short tandem repeats，STR）的荧光定量 PCR（quantitative fluorescence PCR，QF-PCR）技术对MCC进行鉴定。PCR采用德国Eppendorf公司mastercycler nexus 梯度PCR仪。STR片段分析采用美国Thermo Fisher公司ABI 3500Dx一代测序仪及相应常规耗材。若某一浓度梯度DNA样本的STR基因分型图谱中有多个基因座(基因在染色体上的位置)，出现3个等位基因，且疑似污染峰与对照峰比＞15%，说明存在MCC。

1.5 地中海贫血基因分型

采用深圳市亚能生物有限公司α地中海贫血基因检测试剂盒（gap-PCR法）及非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）分别进行缺失型α-地中海贫血检测及点突变型α-地中海贫血检测。

1.6 统计学方法

采用 SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析，计数资料采用%表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QF-PCR技术检测不同浓度MCC样本的结果

QF-PCR技术检测到MCC污染峰的示意图见图1，按照试剂盒说明书要求，疑似污染峰与对照峰面积比＞15%即认为检测到污染峰。而4组不同浓度梯度的模拟样本使用QF-PCR技术检测MCC结果中，在MCC浓度为25%均提示可见污染峰（100%，4/4），但其中1例疑似污染峰与对照峰面积比＜15%；在12.5%提示污染峰的仅1例（25%，1/4）；6.25%及以下均无提示MCC。

2.2 不同浓度MCC样本的α-地中海贫血基因检测结果

4组不同浓度梯度的模拟样本的缺失型及点突变型α-地中海贫血基因检测结果见表1。其中有2组（50%，2/4）样本在MCC浓度12.5%时，缺失型及点突变型α-地中海贫血基因检测结果已不符合，4组（100%，4/4）样本在MCC浓度为6.25%时结果均不符合。另外，有2组（50%，2/4）样本在MCC浓度3.125%时，点突变型α-地中海贫血基因检测结果仍提示为正常，待MCC浓度为1.562 5%时，4组（100%，4/4）样本均检测提示点突变型α-地中海贫血对照点缺失。

图1 不同浓度MCC（仅选取1.562 5%、50%及对照孕妇示意）的QF-PCR检测结果

表1 不同MCC样本的α-地中海贫血基因检测结果

表1 （续表）

3 讨论

在侵入性产前诊断的取材过程中，MCC较为常见[7-9]。是否有取材污染主要取决于侵入操作者的取材技术，但由于产前样本的特殊性，往往不可能因为MCC而再次取材[3]。因此评估MCC对检测结果的影响十分重要。

近年来各产前筛查和诊断机构多采用QF-PCR技术对胎儿样本中的STR进行分析[4-6]。如果出现污染峰就能直观地判断MCC的存在。该方法快捷、简便、且有多个位点可以客观进行分析。但低比例的MCC则无法使用该技术进行检测。英国的临床分子遗传协会的产前诊断分子检测规范中就明确提出低于10%的MCC不在QF-PCR的检测范围内[8]。从本文的结果来看，仅有1例12.5%的MCC在QF-PCR中提示有污染峰的存在，而6.25%及以下均无提示MCC。虽然耿娟等[10]的报道显示QF-PCR仍能检出6.25%的MCC，但对于低比例的MCC的鉴定可靠性已无法保证。然而Jennifer等[11]的报道显示低于10%的MCC仍能对临床检测结果产生影响。

因而本研究对低比例的MCC对α-地中海贫血的产前诊断基因分型结果进行了评估。研究发现同比例的MCC对于不同的检测方法的影响也不尽相同。缺失型α-地中海贫血基因分型在临床上多采用Gap-PCR方法，其原理为PCR扩增后进行电泳。但点突变型α-地中海贫血基因分型多采用反向斑点杂交（Reverse Dot Blot，RDB）方法，其原理为PCR扩增后使用探针进行杂交、显色后观测结果。因此后者的检测灵敏度较高。对于无MCC的Bart's水肿胎样本，Gap-PCR与RDB的检测结果应当相符，即应分别为--SEA/--SEA及无点突变对照点和突变点。但从本文的结果来看，低至6.25%的MCC亦能100%被RDB检测出，12.5%的MCC已经有50%无法被Gap-PCR正确检出。因此出现了表1中各种缺失型及点突变型α-地中海贫血基因结果不相符合的情况。这种不相符带来的结果即有可能造成临床产前诊断的漏诊、误诊，同时也不便于地贫基因产前诊断报告的发布和临床产前诊断咨询的开展。

综上所述，低比例的MCC对α-地中海贫血基因的产前诊断结果存在影响。下一步本实验室会采用先进ddPCR对低比例MCC的鉴定能力进行研究，虽然国内已有类似的研究，但对于临床结果和出生缺陷负担严重的α-地中海贫血的相关产前诊断研究尚不多见[12]。而本文的结果为ddPCR应用于α-地中海贫血产前诊断的高灵敏度MCC鉴定提供了前期研究基础和数据支持。