维持性血液透析乙型肝炎病毒感染患者淋巴细胞亚群变化与CKD-MBD的相关性研究

李侃 王荣珍 史陇珍 刘天喜 魏琪琦 杨蓉 薛潇 杨凯莉 刘明龙

730000 兰州，兰州大学第一医院肾病科(李侃，王荣珍，刘明龙，刘天喜)；兰州大学第一临床医学院(魏琪琦，杨蓉，薛潇，杨凯莉，吕红，史慧敏，尚兰兰，崔治华)；兰州大学第一医院东岗分院肝病科(史陇珍)

维持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者普遍存在免疫功能缺陷是导致其感染和肿瘤等并发症高发的重要原因，严重威胁MHD患者的预后及生存质量[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是多因素参与的免疫炎症反应，西部地区MHD患者合并HBV感染的比例显著高于中东部地区，感染HBV后机体的免疫功能缺陷将进一步加重。日本的1项研究发现，在没有免疫抑制疗法的情况下接受MHD治疗，HBsAg阴性、抗HBc阳性的患者存在HBV再活化的风险，这种现象可能与MHD患者的淋巴细胞免疫功能缺陷有关[2]。淋巴细胞亚群数量及功能是衡量机体免疫状态的重要指标，如果淋巴细胞不能正常识别抗原、激活受阻、分化不平衡或者效应能力下降，就可能导致机体出现一系列免疫缺陷相关的疾病。慢性肾脏疾病-矿物质与骨代谢异常(chronic kidney disease-mineral bone disease,CKD-MBD)在MHD患者远期并发症中的危害随着透析时间的延长日益凸显，关于CKD-MBD对MHD患者淋巴细胞亚群的影响及具体机制目前尚无定论，感染和未感染HBV的MHD患者淋巴细胞亚群如何变化及其可能的影响因素目前报道较少，本文旨在通过比较两组患者淋巴细胞亚群与CKD-MBD之间的变化及相关性，阐明CKD-MBD在感染HBV的MHD患者免疫功能缺陷中可能发挥的作用。

资料与方法

一、研究对象

选择兰州大学第一医院血液净化中心2018年1月至2019年1月期间门诊接受MHD治疗的患者62例作为研究对象。以其中29例进入透析前已确诊慢性HBV的患者(HBsAg阳性且肝功能处于代偿期)作为观察组，即HBV-HD组。33例普通透析患者(HBsAg阴性且肝功能正常)作为对照组，即HD组。

入选标准：(1)所有患者均病情稳定，规律血液透析3个月以上；(2)HCV、HIV及TP均阴性；(3)未使用糖皮质激素及免疫抑制剂；(4)不合并恶性肿瘤、肝硬化、结核等慢性消耗性疾病，营养状况良好；(5)既往1个月内无感染性疾病或潜在感染病灶。

二、研究方法

所有患者均于透析当日清晨空腹在透析通路动脉端采血。全自动血液分析仪检测血常规；全自动生化分析仪检测血钙、血磷、骨碱性磷酸酶、β2微球蛋白、超敏C反应蛋白(hs-CRP)；酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-6；单克隆抗体流式细胞术检测淋巴细胞亚群百分比；放射性同位素法检测全段甲状旁腺素(intact parathyroid hormone,iPTH)。

三、统计学处理

结 果

一、患者的基本资料

两组患者性别、年龄匹配，在透析时间、透析通路、透析模式及原发病构成等方面无明显差异。(表1)

二、两组患者血常规的比较

在血常规检查中，16.13%(10/62)的患者观察到白细胞计数降低，5例升高，53.23%(33/62)的患者有淋巴细胞百分比降低，3例升高(图1)；与HD组相比，HBV-HD组淋巴细胞百分比和绝对值降低更明显(P<0.05)。(图2)

图1 两组患者血常规的比较

三、两组患者淋巴细胞亚群的比较

与HD组相比，HBV-HD组T淋巴细胞百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其中Th细胞百分比、CD4+/CD8+比值降低(P<0.05)，Treg细胞百分比升高(P<0.01)，Ts细胞差异无统计学意义(P>0.05)，B淋巴细胞差异无统计学意义(P>0.05)，NK淋巴细胞百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(表2)

表1 两组患者基本信息的比较

表2 两组患者淋巴细胞亚群的比较

注：αP<0.05图2 两组患者白细胞计数、淋巴细胞百分比和淋巴细胞绝对值的比较

四、两组患者矿物质与骨代谢水平及微炎症状态的比较

与HD组相比，HBV-HD组的iPTH水平和钙磷乘积增高(P<0.05)，hs-CRP、TNF-α水平增高(P<0.05)，IL-6水平显著升高(P<0.01)，两组血钙、血磷、β2微球蛋白、骨碱性磷酸酶水平无明显差异(P>0.05)。(图3)

五、两组患者淋巴细胞亚群与CKD-MBD之间的相关性分析

相关分析显示，两组患者的Th细胞百分比、CD4+/CD8+比值、NK淋巴细胞百分比与iPTH水平和钙磷乘积之间存在负相关性。(表3～4、图4)

表3 HD组患者淋巴细胞亚群与CKD-MBD之间的相关性

表4 HBV-HD组患者淋巴细胞亚群与CKD-MBD之间的相关性

注：aP<0.05;bP<0.01。图3 两组患者矿物质与骨代谢水平及微炎症状态的比较

图4 两组患者淋巴细胞亚群与CKD-MBD之间的相关性

讨 论

随着血液净化技术的不断改进和发展，MHD患者的生存质量明显提高，生存周期也明显延长，但病死率仍居高不下。甘肃省MHD患者5年生存率常年徘徊在50%左右，远远低于同期北上广深及其他中东部地区的平均水平。MHD患者免疫功能缺陷主要表现为：对感染的易感性增加、耐受器官移植、肿瘤发生率高和对疫苗的反应性低等[1]。我国是乙肝大国，尤其在甘肃、青海、宁夏、新疆、西藏等少数民族聚集省份，更是存在庞大的HBV感染人群，HBV感染患者常伴有免疫功能异常，MHD患者一旦合并HBV感染，免疫缺陷程度将雪上加霜[3]。随着甘肃省慢性乙肝、高龄和带管透析的MHD患者逐年增多，心脑血管疾病在我省MHD患者临床终点事件中所占的比例有所下降，而感染、恶液质、肿瘤、CKD-MBD等并发症所占的比例越来越高。淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，其数量减少及功能缺陷直接参与MHD患者多种并发症的发生和发展。因此，制定完善的淋巴细胞免疫功能评估机制及影响因素的靶向干预措施是提高MHD患者整体生存质量及远期生存率的重要途径。

淋巴细胞参与了机体的体液免疫和细胞免疫，在抗感染、抗肿瘤过程中发挥重要作用[4]。人体主要的淋巴细胞亚群可以分为3组：T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群和NK淋巴细胞亚群。T淋巴细胞(CD3+)介导适应性细胞免疫应答，诱导体液免疫发挥辅助性作用，其中Th细胞(CD3+CD4+)即辅助性T细胞，对机体的特异性和非特异性免疫均有重要的调节作用，能协助B细胞产生抗体，也能促进其他T细胞的分化成熟。Ts细胞(CD3+CD8+)即杀伤性T细胞，主要发挥特异性的细胞毒作用，对免疫应答有重要的负调节功能。CD4+/CD8+比值是衡量机体免疫系统稳定的主要因素，比值升高提示免疫功能亢进，比值下降提示免疫功能缺陷[5]。Treg细胞(CD4+CD25+)即调节性T细胞，是一群主动抑制针对自身抗原或外来抗原免疫反应的T淋巴细胞。B淋巴细胞(CD3-CD19+)产生抗体发挥特异性体液免疫功能。NK淋巴细胞(CD3-/CD16+CD56+)即自然杀伤细胞，具有识别被病毒感染的细胞表面表达的相应配体后即对之施加杀伤的作用。

淋巴细胞免疫功能缺陷是MHD患者免疫功能缺陷的主要机制。Meijers等[6-7]研究发现，MHD患者与健康人群相比，Th细胞、Ts细胞和CD4+/CD8+比值降低；将健康人群的Th细胞加入尿毒症患者的血清中进行培养，其表面的抗原受体密度降低40%，T细胞分化受阻、衰老加速。还有研究显示，在终末期肾病患者中NK淋巴细胞表面的活化性受体NKG2D表达下降，其杀伤活性明显降低[8]。引起MHD患者淋巴细胞免疫功能缺陷的原因尚不十分清楚，可能是由于体内尿毒症毒素的蓄积、透析膜生物相容性差和营养不良等综合原因导致的。目前已知的淋巴细胞抑制物主要为中、大分子尿毒症毒素如iPTH、粒细胞抑制蛋白、趋化抑制蛋白、中性粒细胞脱颗粒抑制蛋白、免疫球蛋白轻链以及胍类物质等。iPTH可使淋巴细胞内静息钙离子增加以及单核细胞的吞噬功能减弱，从而使MHD患者免疫功能受损[9]。

HBV感染患者常伴随淋巴细胞亚群数量及功能的改变。研究表明，HBV感染患者与健康人群相比，外周血CD4+和CD8+淋巴细胞数量以及CD4+/CD8+比值降低，其原因可能为HBV感染机体后，T淋巴细胞经抗原刺激后诱发凋亡，由此造成机体清除病毒的能力下降和HBV持续感染，病毒感染状态进一步加重淋巴细胞免疫功能紊乱，从而形成恶性循环[10]。本研究比较了感染HBV和未感染HBV的MHD患者淋巴细胞亚群的变化，结果发现，两组患者均存在不同程度的淋巴细胞亚群数量降低，其中Th细胞、CD4+/CD8+比值的降低和NK细胞的降低在HBV-HD组更为突出，B淋巴细胞亚群和Ts细胞在两组中无显著差异，提示HBV-HD患者免疫缺陷的加重可能与T细胞的免疫应答和NK细胞的识别杀伤能力下降有关。因此，我们认为HBV感染加剧了MHD患者的免疫缺陷，这可能是造成HBV-HD患者HBV难以彻底清除和病毒感染慢性化、对其他微生物感染的易感性增加和恶性肿瘤发生率增高的重要机制。Shen等[11]研究发现乙型肝炎患者外周血中Treg细胞数量较正常人明显增多，具有发挥抑制炎症和维持免疫耐受的作用，且Treg细胞水平与其病毒载量呈正相关。我们的研究结果发现，两组患者Treg水平均低于正常，但HBV-HD组Treg百分比高于HD组，表明虽然尿毒症患者的免疫功能受到抑制，但在感染HBV后机体仍然表现出一定的免疫应答能力。

有报道称甲状旁腺功能亢进可以影响MHD患者的免疫功能[12]。人淋巴细胞表面有甲状腺激素受体，严重甲状旁腺功能亢进的MHD患者，在切除甲状旁腺后，其T淋巴细胞对植物血凝素和刀豆蛋白A刺激引起的增殖反应显著改善，而B淋巴细胞功能无明显变化[13]。本研究发现，MHD患者Th细胞百分比、CD4+/CD8+比值、NK淋巴细胞百分比与iPTH和钙磷乘积之间存在负相关性。与HD组相比，HBV-HD组患者的iPTH和钙磷乘积增高差异具有统计学意义，结果提示CKD-MBD可能参与了MHD患者T淋巴细胞和NK淋巴细胞免疫功能的抑制，HBV感染的MHD患者更容易发生CKD-MBD。由于部分患者正在接受磷结合剂、活性维生素D等药物的治疗，因此两组患者血钙和血磷水平并未表现出明显差异性，而钙磷乘积虽然不被指南推荐作为CKD-MBD的临床治疗依据，但却表现出与iPTH相似的变化趋势，或许可以成为预测疾病预后的重要指标。

MHD患者体内存在一种以细胞因子驱动为特征的慢性微炎症反应，表现为机体在各种因素(化学物质、补体、免疫复合物等)作用下，以单核-巨噬细胞系统激活和促炎症因子(IL-6、TNF-α等)释放为中心的慢性亚临床炎症过程，这也是引起MHD患者血清β2微球蛋白产生增多的重要因素[14]。本研究发现，HBV-HD组较HD组患者hs-CRP、TNF-α、IL-6水平增高，提示感染HBV的MHD患者微炎症状态更加严重，可能与更加严重的淋巴细胞免疫功能缺陷有关。Sun等[15]研究发现，MHD患者微炎症反应中释放的炎性因子TNF-α、IL-6等能够抑制机体的免疫功能，造成Th1/Th2淋巴细胞比例失衡，导致淋巴细胞计数减少和活性降低。由此不难推断，MHD患者CKD-MBD、免疫缺陷、微炎症状态三者之间存在恶性循环，HBV-HD组患者的远期生存质量不容乐观。

综上所述，感染HBV的MHD患者淋巴细胞亚群数量减少较未感染HBV的MHD患者进一步加重，可能与CKD-MBD有关，改善矿物质与骨代谢水平和免疫调节治疗可能对此类患者的预后带来获益。