托瑞米芬逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP耐药性的应用

顾晶晶 张敬毅 孙平 田桂珍

(1淄博市第四人民医院药剂科，山东 淄博 255067；2淄博市第一医院药学部)

肺癌是临床上比较常见的恶性肿瘤之一，目前临床对其治疗主要手段之一为化疗，但对于化疗周期较长的患者来讲，可能出现癌细胞对治疗药物产生一定的抗药性，直接影响化疗效果〔1～4〕。因此临床对于能否应用药物来改善癌细胞对治疗药物的敏感性，并逆转耐药性是临床比较关注的问题。相关研究指出，通过托瑞米芬(TOR)的应用，可增加多种肺癌耐药细胞株的敏感度，并对其产生逆转作用〔5～7〕，本文拟分析TOR对耐顺铂(CDDP)细胞株A549的逆转作用。

1 资料与方法

1.1实验材料 肺癌耐药细胞株A549/cDDP：使用大剂量的cDDP连续冲击12次以上后获得，冲击后经四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测后显示其耐药指数为4.2。枸橼酸TOR：生产厂家为福安药业集团宁波天衡制药有限公司，国药准字H20020047。CDDP：生产厂家为齐鲁制药有限公司。Annexin V/PI 双染色细胞凋亡检测试剂盒、IMDM 培养基、二甲基亚砜及MTT均购于上海钰博生物科技有限公司。

1.2TOR母液的配置方法 称取枸橼酸TOR 2.99 g，将其与5 ml二甲基亚砜进行充分溶解，并加入无血清IMDM 5 ml，混合均匀后即得到500 μmol /L的TOR母液。对其进行除菌、分装后在常温下保存，并避免阳光照射。

1.3MTT检测 应用MTT法检测TOR联合cDDP及单纯应用cDDP对肺癌耐药细胞株A549/cDDP药物敏感性的影响。首先将选定的A549/cDDP菌株进行复苏处理并培养，当其达到指数生长期后，对其使用胰蛋白酶(0.25%)进行消化处理，然后使用生理盐水进行洗涤，洗涤后计数。取胎牛血清IMDM 培养液(体积分数为10%)配置成单个细胞悬液(5×104ml)，将其接种于96孔培养板中， 100 μl/孔，将其放置在浓度为5%的CO2培养箱中，温度保持在37℃，在此种环境下放置一夜，保持其生长，当细胞壁贴壁时即代表生长较好。将其分为单独cDDP组、5 μmol/L TOR联合cDDP组及10 μmol/L TOR联合cDDP组，其中单独cDDP组浓度分别为200、100、50、20、10、5 μmol/L。以上各种药物浓度均设置4个复孔，并设置阴性对照组、阳性对照组、5 μmol/L TOR对照组及10 μmol/L TOR对照组，其中阳性对照组中含有1%的二甲基亚砜，阴性对照组为等体积的无血清二甲基亚砜。然后加入受试药物cDDP，最后的浓度为200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L及5 μmol/L；将浓度为5 μmol/L和10 μmol/L的 TOR放置在饱和湿度，温度为37℃及5% CO2的环境下进行静止培养，培养时间为68 h，然后加入浓度为5 mg/ml的MTT 20 μl/孔，继续培养4 h，培养满72 h后去除上清液，同时加入二甲基亚砜15 μl/孔，充分震荡10 min后，观察结晶全部溶解后使用全自动酶标仪检测各孔吸光度值(A)，波长为492 nm。

1.4计算公式 药物对细胞抑制率=阳性对照孔A-加药孔A/阳性对照孔A×100%。半数抑制浓度(IC50) 根据曲线方程求得。逆转倍数=cDDP IC50/(cDDP+TOR)IC50。

1.5使用流式细胞仪检测cDDP及cDDP+TOR联合用药诱导肺癌耐药细胞株A549/cDDP 采用Annexin V/PI 双染色法检测细胞凋亡和药物浓度，所有操作严格按照试剂盒说明展开，采用Coulter XL-MCL 流式细胞仪收集细胞，每个样本均收集10 000个细胞。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0统计学软件进行t和χ2检验。

2 结 果

2.1MTT 比色试验结果 当单独TOR浓度为5 μmol/L和10 μmol/L时，其对于A549/cDDP细胞的增殖未造成明显影响(P>0.05)；当TOR和cDDP共同应用时， 5 μmol/L和10 μmol/L浓度均能提高cDDP对于A549/cDDP细胞的敏感性，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 TOR联合cDDP及单独应用cDDP对肺癌耐药细胞株A549/cDDP药物敏感性的影响

2.2cDDP+TOR 联合用药逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP对cDDP的耐药性 cDDP浓度为200、100、50、20、10、5 μmol/L时均可抑制A549/cDDP 细胞，且随着浓度的上升，其抑制程度也会增加。当cDDP 与TOR 联合应用时，cDDP浓度为10 μmol/L或者5 μmol/L，均可提升cDDP对于A549/cDDP 细胞的敏感性，差异有统计学意义(t=8.879，P=0.002)，IC50 值为39.04 μmol/L时，其逆转倍数为2.04 倍，IC50 值为30.61 μmol/L时，其逆转倍数为2.61倍当cDDP 浓度为200 μmol/L时，cDDP+TOR终浓度5 μmol和cDDP+TOR终浓度10 μmol/L之间存在统计学意义(t=8.657，P=0.000)，其他浓度时无统计学意义(P>0.005)。cDDP+TOR 终浓度5 μmol/L与cDDP+TOR 终浓度10 μmol/L之间仅在cDDP浓度为200 μmol/L时两者差异有统计学意义(t=2.965，P=0.006)。见图1。

图1 为TOR逆转cDDP对A549/cDDP抑制曲线

3 讨 论

随着人们生活习惯及生活环境的改变，罹患肺癌的人群越来越多，非小细胞肺癌(NSCLC)作为最为常见的肺癌类型具有较高的死亡率。在既往研究中指出，NSCLC具有天然的耐药性，且耐药群体比较广，在化疗过程中经常会出现癌细胞对化疗药物耐药的情况出现，这直接导致化疗效果下降，影响治疗效果〔5,7〕。针对此问题临床很多学者均进行了研究，且指出NSCLC患者的癌细胞组织中雌激素受体(ER) 水平相对较高，且ER水平的高低及其阳性表达率与肺癌的分化程度有一定关系，同时与组织学类型也有着密切的关系〔8～11〕。

TOR是ER的拮抗剂，其在1979年研制出的一种抗肿瘤药物。其与传统的拮抗剂相比，在治疗肿瘤方面具有毒性小，副作用少的作用，同时还具有不致癌、不致畸的特点，当其与化疗药物联合应用时，其可以逆转药物耐药作用，增加抗肿瘤药物的敏感性〔8～10〕。

相关研究指出，TOR的逆转药物耐药作用及增加抗肿瘤药物的敏感性〔11～13〕，其主要机制如下：(1)TOR在机体的代谢中发挥了很大作用，作用之一即抑制蛋白激酶C 的活性，同时还会降低P 糖蛋白的活性及降低磷酸化水平，在此种作用下使其逆转肺癌的多种药物耐药。(2)肺癌组织具有一定的特点，临床显示此类患者的ER均呈高表达状态， TOR和ER结合对于已经产生激素依赖的肺癌组织产生了明显的抑制作用〔14,15〕。ER是一种Ca2+，同时也是磷脂依赖性蛋白激酶，其直接参与了癌细胞的分化、增殖过程，并起到了重要作用，同时也会对P-gp和MDR1 基因造成一定的影响。TOR作为ER抑制剂其较高的化学活性降低了P-gp 磷酸化水平，达到逆转耐药的作用。同时，PKC 也可促使Topo和LRP的磷酸化，当PKC活性增加后介导了多药耐药，此种途径也是TOR发挥逆转耐药作用的渠道之一。(3)TOR 对Ca2+具有双向调节的作用，对于高浓度的TOR 可以诱导肿瘤细胞凋亡。在细胞信号传递过程中，Ca2+发挥了重要作用，其涉及细胞内广泛的生物学效应。当Ca2+水平上升时，可激活系列Caspase 胞质内蛋白酶和核酸内切酶门降解DNA，促使细胞凋亡。相关研究指出，耐药细胞系A549/cDDP细胞内的Ca2+浓度与敏感细胞系A549相比相对较低，TOR对于Ca2+具有双向调节的作用，高浓度的TOR可以促进Ca2+浓度的上升，促使细胞出现死亡。本研究说明，治疗时使用5 μmol/L剂量可以达到化疗增敏和逆转作用，降低大计量应用导致的毒副作用，对于临床用药有一定的指导意义。

综上，TOR联合cDDP应用时，可以有效提升A549/cDDP的转录和治疗效果，避免了大剂量使用可能带来的毒副作用。