支气管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测在临床肺癌早期诊断中的应用

田祺 赵靖 刘菲菲 罗坤 尹小波 王晓杰 徐淑凤

(秦皇岛市第一医院呼吸与危重症医学科，河北 秦皇岛 066000)

肺癌具有侵袭性高、生长迅速、预后差及复发率高等生物学特点〔1〕，其发病率和病死率在世界范围内均位居各种恶性肿瘤的首位，严重威胁人类的健康及生命安全。我国肺癌发病率及死亡率也位列恶性肿瘤首位〔2〕。肺癌预后差，5年生存率仅为16.1%〔3〕。目前尚无针对肺癌的有效筛查方法，这可能是死亡率高的原因之一。于起病初期发现，进行手术切除是仅有的治愈方法，早期肺癌患者术后5年生存率可达90%〔4〕。因此，肺癌的早期诊断与预后密切相关。但肺癌早期临床表现多无特异性，难以及时察觉，80%患者在诊断时已是晚期(Ⅲ或Ⅳ期)，致使患者的 5年存活率不超过15%〔5,6〕。近年来，肿瘤标志物检测作为肺癌的辅助诊断工具受到更多重视。但目前尚未发现早期肺癌的特异性抗原，用于检测的肿瘤标志物均为非特异性物质，且对特定肿瘤标志物的检测，往往仅对单一某种病理类型具有较高的灵敏度和特异度，而对总体肺癌的灵敏度和准确率不高，早期诊断价值十分有限〔5～7〕。

目前，纤维支气管镜检查是对疑似肺癌患者进行组织学或细胞学检查的标准检查方法。支气管镜检查为微创技术，与其他有创操作相比引发并发症的概率小，具有较高的特异度，但支气管镜检查诊断准确性相对较差，敏感度为30%～69%〔8,9〕。与传统血液相比，支气管肺泡灌洗液(BALF)更靠近肿瘤细胞，是肺癌生物标志物的另一来源。DNA甲基化对于基因表达的调控至关重要，通过改变DNA甲基化而发生的表观遗传改变在多种癌症类型的发生中起重要作用〔10,11〕。相关证据表明，矮小同源盒基因(SHOX)2和RAS关联域家族(RASSF)1A的启动子甲基化已被确定为肺癌的诊断和预后的生物标志物〔12,13〕。本文拟综合评价BALF中基因SHOX2、RASSF1A甲基化和细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、鳞状细胞癌抗原(SCCAg)4种肿瘤标志物检测对早期肺癌诊断的价值，并探讨不同指标联合检测的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1～12月在秦皇岛市第一医院就诊疑似早期肺癌进行纤维支气管镜检查的153例患者。经过一系列排除标准，最终134例进入研究。所有患者根据组织学结果进行最终诊断，肿瘤分期参照2010年修订的美国癌症联合委员会(AJCC)分期体系(第7版)确定。其中67例早期肺癌患者纳入肺癌组，67例良性病变患者纳入对照组。肺癌组男30例，女37例，平均年龄58岁，鳞状细胞癌32例，腺癌27例，小细胞肺癌8例；对照组男33例，女34例，平均年龄59岁，肺部感染30例、结核20例、支气管扩张等良性疾病17例。两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)；肺癌组肺泡灌洗液甲基化结果，SHOX2及RASSF1A基因的ΔΔCT值(7.15±4.82、6.47±3.87)比较差异无统计学意义(t=0.908，P>0.05)。

1.2收集BALF标本 纤维支气管镜术前向患者及家属交代纤维支气管镜检查目的、风险及注意事项，并签署知情同意书。术前进行吸氧、生命体征检测，术中对所有患者经鼻插入纤维支气管镜，先检查健侧支气管，再根据患者胸部 CT 对病变部位进行检查，用20～40 ml生理盐水冲洗病变肺段。以10 000 r/min离心5 min的10 ml BALF沉淀用于DNA提取。提取基因组DNA采用标准的DNA提取试剂盒(TIANamp基因组DNA试剂盒，天根生物技术有限公司，中国北京)，并使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research，美国)用亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶。立即检测DNA样品或将其保存在-80℃。

1.3肿瘤标志物检测 入院第2天抽取晨起空腹静脉血5 ml，采用罗氏 Elecsys2010 电化学发光全自动免疫分析仪及配套试剂检测CEA、NSE、SCCAg、CYFRA21-1。所有过程由经验丰富的医师按照说明书操作完成。

1.4RT-PCR 用人甲基化SHOX2和RASSF1A基因检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司)分析未修饰的DNA。基因组DNA中未甲基化的C碱基被亚硫酸盐修饰为U碱基，然后在PCR扩增过程中被修饰为T碱基，而甲基化的C碱基保持不变，因此可以区分甲基化和未甲基化的C碱基。使用TaqMan探针，以甲基化的SHOX2和RASSF1A DNA质粒为对照，通过TaqMan探针检测使用针对不同序列的特异性引物进行PCR扩增的产物。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、多因素Logistic回归分析，构建受试者工作特征(ROC)曲线，计算截断值，计算ROC曲线下面积(AUC)以评估诊断效果。

2 结 果

2.1SHOX2及RASSF1A甲基化检测情况 采用 RT-PCR 法检测BALF，基因SHOX2甲基化诊断灵敏度为80.6%，特异度为82.1%，诊断准确率为81.3%；其中肺癌组SHOX2阳性54例，阴性13例；对照组阳性12例，阴性55例。BALF基因RASSF1A甲基化，灵敏度为79.1%，特异度为85.1%，诊断准确率为82.1%；其中肺癌组RASSF1A阳性53例，阴性14例；对照组阳性10例，阴性57例。血清肿瘤标志物Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg对肺癌诊断的敏感度、特异度分别为：56.7%、85.1%；37.3%、80.6%；49.3%、89.6%；26.9%、80.6%。SHOX2及RASSF1A与血清肿瘤标志物Cyfra21-1(χ2=8.87、7.71)、CEA(χ2=25.94、24.05)、NSE(χ2=14.45、12.98)、SCCAg(χ2=39.90、36.69)对早期肺癌诊断的灵敏度差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2多因素Logistic回归分析 以是否患有肺癌(赋值：是=1，否=2)为因变量，Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg、SHOX2 ΔΔCT及RASSF1A ΔΔCT值为自变量，结果显示Cyfra21-1、NSE、SHOX2 ΔΔCT及RASSF1A ΔΔCT值是肺癌的影响因素(P<0.05)，见表1。

表1 BALF基因RASSF1A、SHOX2甲基化、肿瘤标志物对肺癌影响的多因素Logistic 回归分析

2.3BALF基因SHOX2、RASSF1A甲基化ΔΔCT值、血浆Cyfra21-1、NSE诊断早期肺癌的ROC 曲线 以上述指标为检验变量，以是否患肺癌为分类变量绘制ROC 曲线，结果显示SHOX2 ΔΔCT值诊断肺癌的AUC 为0.846，最佳截断值为10.7时，灵敏度为83.6%，特异度为84.0%；基因RASSF1A ΔΔCT值诊断肺癌的AUC为0.809，最佳截断值为14.5时，灵敏度为88.1%，特异度为80.6%；血清Cyfra21-1值诊断肺癌的AUC为0.792，最佳截断值为3.4时，灵敏度为55.2%，特异度为85.2%；血清NSE值诊断肺癌的AUC 为0.784，最佳截断值10.7时，灵敏度为58.2%，特异度为86.6%；SHOX2、RASSF1A基因ΔΔCT值诊断肺癌的AUC，显著高于Cyfra21-1 AUC值(Z=-9.722、-9.389，P<0.05)，但与NSE诊断肺癌AUC值差异无统计学意义(Z=-1.477、-1.191，P=0.14、0.23)；以SHOX2 ΔΔCT值联合RASSF1A基因ΔΔCT值为检验变量，绘制ROC曲线，诊断肺癌的AUC值为0.935，灵敏度升高至91.0%，特异度升高至88.1%，显著高于SHOX2、RASSF1A、NSE和Cyfra21-1诊断肺癌的ROC曲线(Z=-14.171、-14.176、-14.174、-14.173，均P<0.05)。见图1～3。

图1 血清肿瘤标志物Cyfra21-1、CEA、NSE、SCCAg对早期肺癌诊断的ROC曲线

图2 SHOX2、RASSF1A ΔΔCT值对早期肺癌诊断的ROC曲线

图3 SHOX2联合RASSF1A ΔΔCT值对早期肺癌诊断的ROC曲线

3 讨 论

SHOX2甲基化于2010年作为一种生物标志物被引入，研究表明其能够在523个有效测量样本的病例对照研究中区分恶性和良性疾病，灵敏度为68%，特异性为95%〔14〕。在2011年进行的343个有效标本的病例对照研究中，SHOX2生物标志物在血浆中的表现灵敏度为60%，特异性为90%〔15〕。近年来，国内外研究多次对肺癌患者进行了血浆样本中SHOX2和RASSF1A的甲基化分析，揭示了肺癌早期诊断与检测SHOX2和RASSF1A基因异常甲基化变化之间的关系，然而，血浆标本中SHOX2检测灵敏度(60.00%)和RASSF1A基因(52.4%)并不能令人满意〔16～18〕。

研究表明，在患者体内的5种标本中均可获得SHOX2及RASSF1A基因甲基化的阳性结果，包括淋巴结、胸腔积液、BALF、肿瘤组织、外周血。其中，BALF是一种通过纤维支气管镜检查容易获得的无创标本，是疑似肺癌患者的常规检查项目。由于其邻近肿瘤细胞，BALF的SHOX2及RASSF1A基因甲基化可望成为肺癌早期筛查的重要工具。

本研究结果证实，BALF的SHOX2及RASSF1A基因甲基化对肺癌的早期诊断具有高效的诊断能力，有可能成为一种有前途的肺癌诊断生物标志物，并在早期肺癌诊断中作为细胞学的辅助工具。

本研究结果提示，血清Cyfra21-1、NSE及SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平可在一定程度上独立反映早期肺癌的情况，这与Schneider等〔19〕关于SHOX2 基因甲基化及Korse等〔18〕关于肿瘤标志物对肺癌诊断的研究结果具有较好的一致性。单一的SHOX2及RASSF1A基因甲基化对早期肺癌辅助诊断存在价值，SHOX2 基因甲基化诊断早期肺癌灵敏度为80.6%，特异度为82.1%，RASSF1A 基因甲基化，灵敏度为79.1%，特异度为85.1%。而单一的肿瘤标志物对早期肺癌诊断的临床应用价值有限，本试验表明联合SHOX2及RASSF1A具有成为肺癌早期诊断的重要生物标志物的潜力。相关研究表明，BALF中的生物标志物具有比血清样品更早出现，浓度更高的特点〔20〕。因此，BALF中生物标志物的检测可能为肺癌的诊断提供重要的信息，尤其是在早期阶段。

此次试验仍存在一些不足，试验对照组很难从健康个体中获得BALF样本，因此选取了患有肺部良性疾病的患者。另外，这两个基因的甲基化变化是否与肺癌患者的预后相关还不清楚。可进一步对SHOX2和RASSF1A基因未甲基化的肺癌患者预后进行评价。因此，BALF中SHOX2和RASSF1A的甲基化分析在肺癌诊断中具有高效的诊断能力，尤其是在早期。它有可能成为一种有前途的肺癌诊断生物标志物，并在肺癌诊断中作为细胞学的辅助工具。