曲霉降解玉米秸秆制备燃料乙醇的工艺研究

柴成朋 张宏坤

摘要：  燃料乙醇作为新型能源的替代品，近年来备受世界各国的青睐。而使用丰富且低廉的玉米秸秆资源代替供应粮制备燃料乙醇，这在很大程度上减轻了国内粮食供应不足的现状，与此同时，它也能够推动国家经济发展，并降低焚燒过程对环境污染所造成的负面影响。在这里本实验团队采用玉米秸秆作为生产燃料乙醇的原料，它不仅成本低，而且生长周期短、易于获得。玉米秸秆主要成分是由木质素、纤维素、半纤维素组成，此外还含有灰分、少量的蛋白质。而木质素与纤维素在空间上会通过共价键形成特殊的网状结构，因此在水解过程中会很大程度上较低水解的活性。因此，在这里本实验团队采用酸性高温条件下进行水解，使其克服共价键断裂所需的能垒形成单糖，并利用直接滴定法测定酸性条件下不同温度条件下还原糖含量，实验结果表明，得出在酸性条件下，增加水解温度可以加快多糖的水解开环，形成新的游离羟基，使纤维素的结晶度降低进而转化为单糖 。只有将玉米秸秆中纤维素与木质素充分降解为还原糖，才能够使其在低酸性条件下进行菌株发酵制备燃料乙醇。这样不仅很大程度上保护了菌株发酵的活性，而且使能还原糖高效的转化为燃料乙醇。利用气相质谱分析的方法，通过质谱碎片峰与总离子流图结合分析，确定产物中含有乙醇分子

关键词：玉米秸秆;气相色谱—质谱;燃料乙醇;还原糖;曲霉

针对玉米秸秆中木质素与纤维素在空间上通过共价键形成的特殊网状结构，加之不同的纤维素存在着不同的晶体结构、以及原料内孔面积，这将使在水解过程中需要消耗很多能量才能克服断裂共价键所需的活化能[1-3]。所以，如何选取有效的水解玉米秸秆的方案将成为一个首要解决的问题，在传统过程中，常采用酶解、物理爆破、低酸度水解的方案去处理玉米秸秆，这在很大的程度上都不能彻底将玉米秸秆水解，因此，本实验采用强酸高温水解的方法进行对玉米秸秆水解。其中采用控制不同温度水解的方法是本研究的一个亮点[4-6]。实验数据表明，在相同时间作用下，通过控制不同水解温度对玉米秸秆进行水解，可以得出在在高温条件下可以加快多糖的水解开环，产生新的游离羟基，使纤维素的结晶度降低进而转化为单糖。同时，该反应是吸热反应，根据勒夏特列原理，升高温度有利于反应的正向进行，进而又一步印证了纤维素水解的反应速率与升温有关。

欲将水解产物进行菌株发酵，就需控制较小酸度才能使菌株存活下来，从而使菌种在更好的条件发酵生产燃料乙醇。在传统的酿酒工艺中会常常加入酒曲，以提高酒的产量和香醇度，该种菌在水解液中可以更好的捕捉糖分进行发酵。曲霉一般可通过土豆为载体进行培养纯种，选取长势较好的2-4个单菌落进行分离纯化。可以利用微生物自动鉴定仪进行观察菌株的分布与长势。根据后续实验可以得出曲霉存在种间优势，且繁殖快，对生长环境不是很苛刻，进而证明了曲霉在发酵制备燃料乙醇的过程中为最佳菌株[7-10]。

一、实验材料与方法

（一）实验材料

玉米秸秆取自农田、酒曲购买于安琪公司

（二）实验仪器

气相—质谱联用仪、锥形瓶、量筒、烧杯、漏斗、容量瓶、电子天平、移液管、电炉、酸式滴定管

（三）实验试剂

浓硫酸、0.1%的葡萄糖标准溶液、菲林甲乙试剂、亚甲基蓝指示剂

二、实验方法

（一）直接滴定法测定还原糖

1.空白滴定

准确移取各5.00mL菲林甲、乙试剂于250mL锥形瓶中，加入约8mL葡萄糖标准溶液，摇匀，置于电炉上进行加热至沸腾，以每1-2s一滴的速度滴入葡萄糖标准溶液中，直至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积（V0）

2.直接滴定

称取5g粉碎的玉米秸秆置于五个平行的烧杯锥形瓶中，依次加入不同酸度的浓硫酸溶液，水浴加热至65，在锥形瓶上放置表面皿（以免加热过程中水分流失，增大还原糖浓度，影响测量结果），水浴时间为1小时，之后冷却至室温，将玉米秸秆的水解液通过漏斗过滤至锥形瓶中密封保存备用，滴加碱液使PH调至中性。将待测溶液分别移取1mL置于250mL的锥形瓶中，准确移取菲林甲乙试剂各5.00mL加入其中，摇匀，之后置于电炉上加热至沸腾，以每1-2s一滴的速度滴加标准葡萄糖溶液，直至溶液蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准溶液体积（V1）

（二）菌株发酵制备燃料乙醇

通过直接测定法，得到水解效果较好的酸度，将已经水解好的样品调解PH至中性，准确称量0.5g酒曲杆菌加入至锥形瓶中，用胶塞将瓶口密封，进行无氧呼吸。控制水浴温度为35，水浴时间为72个小时，之后将水浴样品置于阴凉处，避免光线直射，72h后就可以获得发酵好的乙醇溶液，再通过蒸馏装置将所需的乙醇溶液从混合发酵溶液中分离出来。

三、结果与讨论

（一）气相色谱质谱联用法分析样品液中乙醇分子

在气相色谱仪部分，采用毛细管开管柱可以消除涡流扩散，同时管壁上的液膜很薄，也可以极大地降低固定相传质，所以单位柱长的柱效高，有利于分析较为复杂样品，而在质谱部分，则采用四极杆质量分析器，通过改变射频电压振幅比率或射频频率以实现质量扫描，让质荷比不同的离子可以依次抵达检测器，其分辨率很高，且对样品分析很快根据分子特殊离子碎片，麦氏重排离子，就可以在谱库检索中查到质谱图上的分子，同时与总离子流图比对分析，通过图1-1和1-2可以得知，在峰A处为乙醇分子峰。

（二）不同温度下对玉米秸秆水解的测定结果

在一定酸度条件下，控制时间变量，进行测定不同温度条件下对水解率的影响，测定结果见表1-1、图1-3。

在玉米秸秆中，纤维素会在空间上通过特殊的共价键相互连接，而想要断裂共价键就得需要克服很大的能垒，才会使多糖开环，产生游离的羟基，加快水解速率，从图1-3可知，在相同时刻下，温度升高可以促进玉米秸秆水解，由此可见，温度的升高对水解速率成正比，综合各种因素，从节能角度和可行性考虑，水解最佳温度为100℃。

（三）测定消耗残糖量于乙醇产量之间测定结果

在无氧条件下，对酒曲杆菌消耗培养基中的还原糖进行测定，推断水解液中还原糖在菌株作用下，残糖含量与乙醇产生之間的关系。实验测定结果见表1-2和图1-4。

如图1-4所示，酒曲杆菌在无氧呼吸作用下，它会捕捉培养基中的还原糖补充自身的养分，进行繁殖产生更多的后代，随着发酵时间增加，残糖量会持续降低，而自身无氧呼吸的产物会持续升高，他们之间存在着反比关系。

（四） 培养基中葡萄糖浓度对乙醇产量测定结果

在不同时间段内，依次利用移液枪从发酵液中取出5mL样品，进行过滤处理，之后将处理好的样品送入气相色谱，测定乙醇的含量，数据可见表1-3

从图1-5可知，当葡萄糖含量达到90g/L时，乙醇的产量达到峰值，随着葡萄糖含量的继续增加，溶液中的渗透压持续升高，导致发酵过程中酒曲杆菌不能有效的进行无氧呼吸，产生乙醇。所以可以得出，在葡萄糖含量达到90g/L的条件下为最适宜的发酵条件。

（五）菌落前期培养的竞争结果

从图1-6中可以看出曲霉、毛霉、根霉、孢霉的生长分布，而曲霉在繁殖过程中存在种间优势，繁殖数量最多且繁殖速率最快，而其他菌种的竞争能力较小，且对生存条件较为苛刻，所以综上所述，曲霉是最佳菌种。

四、结论

（一）玉米秸秆的最佳水解温度的确定

在酸性条件下，针对玉米秸秆进行水解实验，可得出结论，随着水解液的温度不断提升，可以加快玉米秸秆中纤维素之间共价键的断裂，迫使游离的羟基裸露出来，增加亲水性，进而降低了纤维素的结晶度，加快多糖的开环产生单糖。

（二） 气相色谱质谱联用的测定

利用气相色谱的在确定的温度条件下，样品在惰性的流动相与毛细管柱之间不同分配比的差异，使样品可以通过沸点高低的不同，先后从色谱柱中流出，通过接口部分将样品流入离子源形成带电离子，同时要控制接口的温度要稍低于柱温，之后在质谱仪部分利用不同的质荷比分析出样品，通过以上操作，本团队成功的检测样品中含有乙醇分子。

（三）最佳菌种选择

通过多天菌株的培养，本实验团队从各种菌种中塞选出长势最佳的菌株，酒曲霉素是一种兼性厌氧型菌株，它可以通过无氧呼吸降解培养液中的还原糖产生燃料乙醇，根据沸点不同的特性，则采用蒸馏的方法将其温度控制在78-79度沸点之间，获得所需的馏分燃料乙醇。

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[10] The effect of biomass moisture content on bioethanol yields from steam pretreated switchgrass and sugarcane bagasse. EWANICK S，BURA R. Bioresource Technology . 2011

基金项目：黑龙江省大学生创新创业训练项目（201910234016）

作者简介：

张宏坤 （1979-）， 男，黑龙江海伦人，副教授，博士，主要从事有机与高分子材料合成研究工作。