定量核磁共振波谱法测定白芷中欧前胡素含量

杨 兰， 李 欠， 冯彦梅， 邱黛玉

(甘肃农业大学农学院中草药栽培与鉴定系，甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室，甘肃 兰州 730070)

中药白芷为伞形科植物白芷[Angelicadahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.]或杭白芷[A.dahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan]的干燥根[1]，始载于《神农本草经》，并列为中品，因干燥初生根为芷，色白，故名白芷，在中国有着悠久的药食两用的历史[2]。白芷性温，气芳香，味辛，微苦，具有解表散寒、通窍止痛、祛风除湿、消肿排脓、抗炎、解热、美白等作用，在临床实践中，广泛应用于风寒感冒、头痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、赤白带下、痈疽疮疡、湿盛久泻等病症，特别是用于风寒侵犯阳阴引起的头痛，其疗效较显著[3-8]。除作药用外，在食品、保健品、香料、护肤美容、日用化工等方面也有广泛的应用[9]，特别是其干燥根作为调味料可增香添味，脱臭除异，增进食欲[10]。

白芷中主要的生物活性成分有香豆素、挥发油、多糖和微量元素[11]。香豆素主要包括欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、水合氧化前胡素和异珊瑚菜素[12]。在2015版药典中常用欧前胡素含量对白芷进行质量评价[13]。目前，欧前胡素的测定多采用高效液相色谱法，该法存在耗时(出峰时间为11.6 min)、样品预处理复杂、标准品价格昂贵等缺点。因此，建立一种快速、可靠的测定白芷中欧前胡素含量的方法具有一定的现实意义[14-18]。近年来，1H核磁共振波谱法(1H qNMR)已被广泛成功地应用于化学药品、中药及植物提取物、液体样品、异构体、食品等的定量分析[19-20]。该法具有检测时间短、样品预处理简单、仪器操作相对简单、特异性好以及分析过程中不需要昂贵的对照品等优点。其基本原理是特征峰的峰面积与质子数成正比，常用绝对内标定量法，即以待测物与已知内标物的峰面积的比值确定待测物的含量[21-26]。

本研究采用氢核磁共振建立白芷中欧前胡素含量测定新方法，并对白芷样品进行分析，并用高效液相色谱法(HPLC)验证测定结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

核磁共振仪(400 MHz，MestReNova数据处理软件，Bruker公司产品)；超声清洗器，深圳市得康科技有限公司产品；HH-S数显恒温水浴锅，江苏正基仪器有限公司产品；电子天平，慈溪市天东衡器厂产品；循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品；JFSD-100粉碎机，上海嘉定粮油仪器有限公司产品；高效液相色谱仪，岛津公司产品。

欧前胡素，上海源业生物科技有限公司产品，≥98%；对苯二酚，上海麦克林生化有限公司产品，≥99%；氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，剑桥同位素实验室有限公司产品，≥99.9%；甲醇，天津市富宇精细化工有限公司产品，≥99.5%。

白芷购于四川省遂宁市的新桥、大英、新胜等地。

1.2 测试条件

采用zg30脉冲序列，测定温度为293.7 K，谱宽(SWH)为8 012.8 Hz，采样时间(AQ)为4.0 s，弛豫时间(D1)为1 s，脉冲宽度(P1)14.90 s，样品扫描次数(NS)32次，空扫次数(DS)为2次。色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：250 nm；进样量：20 μl。

1.3 溶液制备

内标溶液的制备：准确称取30 mg内标物对苯二酚溶解至6.0 ml DMSO中，制得内标溶液，作为核磁共振波谱法(qNMR)定量的内标样品。供试品溶液制备：采用刘红梅等[27]的方法进行制备。取白芷粉末(过40目筛)约25 g，精密称量，置于容量瓶中，精密加入甲醇125 ml，超声波处理(40 min，40 ℃)，静置冷却，取上清液，重复2次。将2次提取液合并，过滤，滤液水浴加热得粗浸膏，称量粗浸膏质量。取粗浸膏0.06 g，精密称量，加0.5 ml内标溶液，超声波溶解，移置核磁管，用于氢核磁共振法测定。取上述粗浸膏0.06 g，精密称量，加入3 ml甲醇，超声波溶解，过微孔滤膜(0.45 μm)，移置进样小瓶，用于高效液相色谱法测定。核磁共振标准品溶液的制备：准确称取3 mg欧前胡素标准品，溶解至0.5 ml内标溶液中，制得标准品溶液，备用。

2 结果与分析

2.1 溶剂、内标与定量峰的选择

测定结果表明，欧前胡素及对苯二酚在DMSO-d6中均有较好的溶解性，且谱峰不重叠，因而选用DMSO-d6作为溶剂，对苯二酚作为内标。以欧前胡素中δ7.65峰为定量峰，对苯二酚中δ6.55峰为内标定量峰(图1)。

2.2 定量核磁共振波谱法的方法学验证

2.2.1 线性关系 分别精密称取标准品3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g，并各加入0.5 ml内标溶液，制备6个不同浓度的样品溶液，测定1H NMR波谱。分别对标准品和内标物特征信号峰的峰面积进行积分，每个样品的积分面积取3次积分的平均值。以标准品和内标物的积分面积比值(Y)对标准品和内标物质量比值(x)进行线性回归，得出回归方程(图2)。图2表明标准品与内标物质量比值在1.2至3.2范围内与两者定量峰面积比值呈良好的线性关系。

图1 欧前胡素(A)、对苯二酚(B)和两者的混合物(C)的1H qNMR波谱Fig.1 1H quantitative nuclear magnetic resonance(qNMR) spectra of imperatorin (A), hydroquinone (B) and their mixture (C)

图2 标准品与内标物质量比、面积比的线性关系Fig.2 The linear relationship of mass ratio and area ratio between standard and internal standard

2.2.2 精密度 取制备的核磁共振波谱法标准品溶液，在核磁共振测试条件下，重复测定5次。以标准品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算相对标准偏差(RSD)，RSD=0.654%。

2.2.3 稳定性 取用于氢核磁共振波谱法测定的溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h进样测定。以样品定量峰与内标物定量峰面积比值计算RSD，RSD=1.339%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.2.4 重复性 在核磁共振波谱法测定溶液制备条件下，平行制备6份供试品溶液，在同一试验条件下测定。以样品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值计算RSD，RSD=1.837%，表明重复性良好。

2.2.5 加样回收率 取同一批已知含量的样品浸膏约0.03 g，精密称量，平行6份，分别精密加入0.5 ml欧前胡素对照品溶液，超声波溶解，移至核磁管，在核磁共振测试条件下测定，计算回收率，结果见表1。

表1 1H核磁共振波谱法(1H qNMR)测定白芷中欧前胡素的回收率

2.3 样品中欧前胡素含量测定及HPLC验证

取制备样品0.06 g，精密称量，制备供试品溶液，进行核磁共振波谱法测定(表2、图3)。计算样品中欧前胡素含量(W1)，W1=A1W2M1n2/A2M2n1，式中W1、W2分别为目标物、内标物的质量，A1、A2分别为目标物、内标物的积分面积，M1、M2分别为目标物、内标物的分子量，n1、n2分别为目标物、内标物的质子数。由表2可知，产自新桥、大英和新胜的白芷中欧前胡素含量分别为0.204%、0.200%和0.220%。另外，采用高效液相色谱法对白芷样品中欧前胡素含量进行测定，结果表明两种方法所得结果无显著差异(表2、图4)。

表2 1H核磁共振波谱法(1H qNMR)和高效液相色谱法(HPLC)测定白芷中欧前胡素含量

图3 新桥(A)、新胜(B)、大英(C)白芷提取物的1H核磁共振波谱图Fig.3 1H qNMR spectra of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

图4 新桥、新胜、大英白芷提取物的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

3 结 论

本试验建立了定量核磁共振波谱法测定白芷中欧前胡素含量的方法。该法具有检测时间短、样品预处理简单、仪器操作相对简单、特异性好、分析过程中不需要昂贵的对照品等优点，且测定结果与高效液相色谱法基本一致。采用1H qNMR法测定了白芷中欧前胡素含量，并用HPLC法验证。结果表明，1H qNMR法和HPLC法的定量测定结果基本一致。1H qNMR法可用于白芷中欧前胡素含量的测定，为白芷质量控制提供了一种快速、有效的新方法。